丁酸钠通过维持乙酰化平衡改善帕金森病模型鼠认知功能和情感障碍

宋玫香，张 岩，王 芳，王 虹，包金风

(徐州医学院药学院药理学教研室，江苏徐州 221004)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常发生于中老年人的中枢神经系统退行性疾病，基本病理改变是中脑黑质致密区多巴胺能神经元坏死、凋亡。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是多巴胺合成过程中的限速酶，催化酪氨酸形成左旋多巴。黑质TH含量和活性降低导致的多巴胺匮乏是PD发病的主要原因。在PD脑组织中，TH表达含量明显下降，表明多巴胺能神经元的数目减少，TH已成为PD模型成功建立的指标之一。近年研究发现PD患者除运动协调功能受到损害，其认知和情感等也受到影响，如记忆力减退和抑郁症的发生。1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)具有较强脂溶性，易通过血脑屏障，选择性浓集于黑质，在单胺氧化酶B作用下，转化为结构与多巴胺类似但有毒性的 1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy1-4-phenyl pyridinium ion，MPP+)，进入多巴胺能神经末梢和胞体，产生氧自由基，导致多巴胺能神经元死亡，可利用MPTP在灵长类动物身上复制出PD动物模型。

疾病的发生是一个多因素、多步骤的过程，是环境与遗传交互作用的结果，如PD和孤独症的发生等都与环境因素密不可分。表观遗传学是疾病发生发展过程中基因和环境相互作用的桥梁，是一种不依赖DNA序列改变的可逆的基因表达调控，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码的RNA表达等。组蛋白乙酰化修饰是表观遗传学调节中研究最早的翻译后修饰，与基因活化关系密切。组蛋白乙酰化水平是由组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)共同决定，二者之间的动态平衡调控着组蛋白的乙酰化/去乙酰化状态，控制着基因转录的启动或关闭。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)靶向作用于 HDAC，主要通过抑制HDAC的活性使组蛋白乙酰化程度升高，引起染色质重组，DNA转录活化或抑制。临床前的实验表明HDACi对于创伤性脑外伤和缺血损伤模型具有神经保护和促进神经发生的作用［1］，在创伤性脑外伤和神经退行性疾病的鼠中HDACi具有保持学习和记忆［2］、增强神经分化和突触可塑性以及抗抑郁功能。但有关HDACi对PD模型鼠学习记忆及情感等方面的研究未见报道。丁酸钠是一种四碳短链脂肪酸，通过抑制HDAC的活性，引起组蛋白超乙酰化，是HDAC的抑制剂。因此本研究利用MPTP建立PD小鼠模型，应用行为学及分子生物学实验方法研究丁酸钠对PD模型鼠认知功能和情感障碍的影响及可能作用机制。

1 材料

1.1实验动物C57BL/6J小鼠，♂，6～8周龄，体质量(20±2)g，实验分为4组:对照组、MPTP组、丁酸钠组、MPTP+丁酸钠组，n=10。动物自由摄食饮水，室温25℃，适应环境1周。实验动物由徐州医学院实验动物中心提供。

1.2药物配制及造模方法MPTP用无菌生理盐水溶解，配制药物浓度为2 g·L－1，制造急性PD模型，腹腔注射 MPTP 20 mg·kg－1，1日4 次，每次间隔2 h;丁酸钠用无菌生理盐水溶解，配制浓度为0.08 g·ml－1，腹腔注射丁酸钠 0.8 g·kg－1。对照组腹腔注射等体积无菌生理盐水。

1.3试剂与仪器MPTP和丁酸钠由Sigma公司提供。RIPA裂解液和BCA蛋白浓度定量试剂盒由碧云天生物技术公司提供;TRIzol总RNA提取试剂盒，TIANScript cDNA第1链合成试剂盒，2×Taq PCRMasterMix试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司。TH抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;HDAC1抗体购自Bioworld Technology，HDAC1引物由上海生工生物工程有限公司合成。

5417R台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);EL104电子天平(梅特勒－托利多上海有限公司);－70℃冰箱(美国Forma公司);SZ93型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂);微波炉(广东美的集团股份有限公司);PE9600PCR反应仪(美国PE公司);EPS300天能电泳仪(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1悬尾实验将小鼠尾巴用医用胶带在距离尾尖1～1.5 cm处牢牢的固定在光滑的金属表面，距离地面30 cm，用一个白色有机玻璃盒将小鼠与周围环境隔开，防止小鼠视觉分散［3］。整个实验由经验丰富且对实验目的不明确的研究人员操作完成，记录6 min内小鼠的活动状态，并计算后4 min内小鼠的不动时间。

2.2Morris水迷宫实验在特定的时间段(8∶00∶00～15∶00∶00)进行，药物给予1 h后开始实验。水温(22±2)℃，水池周围的物品位置固定不变。圆形水池(直径100 cm，高40 cm)被穿过圆心的两条虚拟的垂直直径划分为4个象限，平台(直径12 cm，高20 cm)位于水池中的任意1个象限，平台低于水面1 cm，水中加入脱脂奶粉。将小鼠面向池壁入水，系统跟踪记录，小鼠到达平台并在台上停留5 s视为上台成功;若60 s内小鼠未能找到平台，应将其轻轻引上平台并停留10 s作为强化记忆。在d 5将平台撤除，所有小鼠自同一象限入水，自由游泳60 s，记录小鼠60 s内在虚拟平台所在象限(即目标象限)游泳时间占总时间的百分比，作为小鼠记忆能力的指标。

2.3Western blot检测TH、HDAC1蛋白表达小鼠麻醉后迅速断头取脑，加入RIPA裂解液(含有体积分数为0.01的蛋白酶抑制剂)，冰水中超声破碎，4 ℃ 12 000 r·min－1，离心3 ～5 min，取上清，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品在沸水中变性。配制体积分数0.10的SDS-PAGE分离胶，上样，100 V 恒压电泳，350 mA，80 min转移至PVDF膜，用含质量分数为0.05 BSA的TBST室温封闭2 h，分别加入一抗 anti-TH(1∶200)、anti-HDAC1(1∶500)4℃孵育过夜，洗膜，碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育2 h，碱性磷酸酶标记的显色液显色，扫描。用Image J图像分析软件计算每组蛋白条带的光密度值，对目的蛋白条带与同一样品的βactin的光密度的比值进行比较。

2.4RT-PCR检测HDAC1表达

2.4.1RNA提取取适量冰冻组织置于1.5 ml Eppendorf管中，加入1 ml TRIzol试剂，匀浆，室温放置5 min，加入200 μl氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置3 min。4 ℃，12 000 r·min－1离心10 ～15 min，将上层水相转移到新的Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置 20～30 min，4 ℃，12 000 r·min－1离心10 min，弃上清，加入1 ml体积分数为0.75 的乙醇，4 ℃，5 000 r·min－1离心 5 min，弃掉液体，沉淀室温晾干，加入30 μl ddH2O，反复吹打，混匀，充分溶解RNA。

2.4.2反转录和PCR扩增取5 μg总 RNA，加入2 μl oligo(dT)15，2 μl dNTP，补 RNase-free ddH2O定容至14.5 μl。70℃ 5 min后迅速置冰上2 min，加入 4 μl 5 × First-Stand Buffer，0.5 μl RNase，1 μl TIANScript M-MLV，混匀，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50 μl，取4 μl上述稀释后的反应体系，分别加入0.5 μl目的基因或内参基因的上下游引物(HDAC1上游引物5'-ATCCCTAATGAGCTGCCCTACA-3'，HDAC1 下游引物5'-ATGGAGAAGATGGGGCTGCAGA-3';GAPDH上游引物 5'-TTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3'，GAPDH下游引物5'-GCCATGTAGGCCATGAGGTC-3')，加入 12.5 μl 2 ×Taq PCR Mister Mix，加 7.5 μl RNase-free ddH2O，94℃预变性4 min;94℃ 变性30 s，58 ℃复性 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，35 个循环;72 ℃延伸4 min后保存于4℃。取5 μl PCR产物进行质量浓度为20 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，取胶置于凝胶成像系统进行观察和分析。根据积分吸光度值(IA)对比分析条带的强弱，以HDAC1的IA与GAPDH的IA比值表示HDAC1 mRNA的相对表达水平。

2.5统计学处理应用SPSS16.0统计软件处理实验数据，实验数据均以±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验。

3 结果

3.1丁酸钠对PD模型鼠认知功能和情感障碍的影响

3.1.1悬尾实验与对照组比较，MPTP组小鼠的不动时间明显延长，表明MPTP模型鼠具有明显的抑郁症状;MPTP+丁酸钠组较MPTP组小鼠不动时间明显缩短，表明丁酸钠能够明显改善PD模型鼠的抑郁症状。见Fig 1。

Fig 1 The immobile time of each group in tail suspension test

3.1.2Morris水迷宫实验与对照组相比，MPTP组小鼠寻找平台的潜伏期延长(P＜0.05)，在目标象限游泳时间所占的百分比降低(P＜0.05)，MPTP组小鼠的学习记忆能力明显降低;丁酸钠组与对照组相比，小鼠寻找平台的潜伏期有所增加，在目标象限游泳时间所占的百分比有所减少，但这种差异并没有统计学意义(P＞0.05)，丁酸钠对小鼠的学习记忆能力可能产生一定的损害作用;MPTP+丁酸钠组较MPTP组小鼠寻找平台的潜伏期缩短且在目标象限游泳时间所占的百分比增加(P＜0.05)，表明丁酸钠能够明显提高PD模型鼠的学习记忆能力。见 Fig 2、3。

3.2丁酸钠对PD模型鼠TH蛋白表达的影响与对照组相比，MPTP组、丁酸钠组小鼠脑组织TH表达明显降低(P＜0.05);MPTP+丁酸钠组较MPTP组小鼠脑组织TH表达明显升高(P＜0.01)，表明丁酸钠能够明显保护PD模型鼠多巴胺能神经元。见Fig 4A，4B。

Fig 2 Comparison of the escape latency period(time to platform)for 4 consecutive days in Morris Water Maze test

Fig 3 The percentage time in the target quadrant indicates the degree of memory consolidation in the fifth day of the Morris Water Maze test

3.3丁酸钠对PD模型鼠HDAC1蛋白表达和mRNA水平的影响Western blot和RT-PCR检测结果显示，与对照组相比，MPTP组和丁酸钠组小鼠脑组织中HDAC1蛋白表达和mRNA水平明显降低(P＜0.01，P＜0.05);MPTP+丁酸钠组与MPTP组相比HDAC1蛋白表达和mRNA水平升高(P＜0.05)，结果表明PD模型鼠组蛋白乙酰化内稳态发生失调，丁酸钠能够修复和维持PD模型鼠的组蛋白乙酰化的平衡状态。见Tab 1。

4 讨论

Tab 1 Influence of sodium butyrate on HDAC1 mRNA level in brain tissues of acute PD model mice(±s，n=3)

Tab 1 Influence of sodium butyrate on HDAC1 mRNA level in brain tissues of acute PD model mice(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs MPTP model group

Group HDAC1/β-actin Control 0.360 ±0.011 MPTP model 0.257 ±0.010＊＊Sodium butyrate 0.332 ±0.016*MPTP plus sodium butyrate 0.279 ±0.011#

Fig 4 The protein expression of TH and HDAC1 in different groups assayed by Western blot

研究发现，50%的早期PD患者伴有轻度认知障碍，主要包括视空间障碍、记忆改变、智力改变以及情感障碍等。视空间障碍是PD最常见的认知障碍，患者早期即有视觉空间记忆损害，且主要影响相对空间工作记忆;情感障碍主要包括抑郁、焦虑和淡漠，一般抑郁的发生率为40% ～45%，程度为轻到中度，到晚期几乎100%病人都伴有抑郁症状，抑郁是PD病人睡眠障碍、日常生活能力和生活质量下降的主要危险因素［4］。多巴胺是脑内的主要的神经递质之一，在运动、动机、学习记忆和情感等方面起着重要的作用。研究表明［5］，多巴胺能神经元能够参与调控与果蝇记忆有关的神经环路。中脑边缘系统多巴胺通路的失调可引起认知和情感障碍及精神神经系统疾病。TH是多巴胺合成过程中的限速酶，TH表达水平的高低可以反映出多巴胺神经元的生存与丢失。研究显示［6］MPTP模型组小鼠黑质纹状体内TH水平降低，小鼠纹状体内多巴胺水平也降低，表明PD模型成功建立。本研究采用C57BL/6J小鼠腹腔注射MPTP制造急性PD模型，MPTP模型组与对照组比较，TH蛋白表达明显减少表明MPTP模型组多巴胺神经元损伤或死亡;小鼠寻找平台的潜伏期明显延长，在目标象限所占时间百分比明显降低，悬尾实验中小鼠的不动时间明显延长，表明MPTP组小鼠的学习、记忆能力降低，并出现抑郁样行为。

组蛋白乙酰化失衡已成为神经退行性疾病以及一些与年龄有关的记忆障碍疾病的主要发病机制。研究表明［7］APPPS1-21转基因鼠前脑区淀粉样蛋白病变与组蛋白乙酰化明显失调紧密相关，在阿尔采末病(Alzheimer’s disease，AD)发病早期，经HDACi丁酸钠长期处理能够提高APPPS1-21鼠的相关记忆功能，记忆能力的恢复与组蛋白乙酰化水平的升高以及与学习能力有关的基因表达的增加紧密相关。对Tg2576 AD鼠每天注射4-苯基(一种HDACi)后，在不影响Aβ水平的前提下能够使海马区tau蛋白磷酸化恢复正常，从而逆转其空间记忆障碍［8］。对APP23转基因AD鼠，每天腹腔注射低剂量的丙戊酸(一种HDACi)，能够明显减少Aβ斑块数，且早期治疗能够改善其记忆障碍［9］。组蛋白的乙酰化/去乙酰化修饰在抑郁症发病机制和抗抑郁治疗的过程中也起到重要作用。三环类抗抑郁药物丙咪嗪能够改善抑郁小鼠模型中长期的应激刺激造成的行为学损害，这种抗抑郁作用能够被海马组蛋白去乙酰化作用阻断。丁酸钠能够提高小鼠海马及前额叶脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表达，长期应用电休克治疗抑郁症能够使大鼠海马BDNF启动子上组蛋白的乙酰化增加，BDNF表达上调，BDNF在学习、记忆以及高级认知功能方面有重要的作用［10－11］。PD模型鼠经过HDACi丙戊酸、丁酸钠或曲古菌素处理后，HDACi能够明显减少由MPP+诱导的TH阳性神经元的死亡［12］。本研究发现，MPTP+丁酸钠组与MPTP组相比，TH蛋白表达增加，在Morris水迷宫实验中，前者寻找平台的潜伏期明显缩短且在目标象限所占时间百分比明显增加，悬尾实验中，前者不动时间较后者明显缩短，表明丁酸钠能够保护多巴胺神经元，明显提高PD模型鼠的学习记忆能力，改善PD模型鼠抑郁症状。

本研究发现，丁酸钠组与对照组相比，TH蛋白表达明显减少，小鼠寻找平台的潜伏期有所延长且在目标象限所占时间百分比有所降低，小鼠的不动时间缩短。我们前期研究结果显示，体外培养的新生小鼠神经元，不同浓度的丁酸钠(1.25、2.5、5、10、20 mmol·L－1)能够诱导神经元凋亡，并且随着丁酸钠剂量的增加，其诱导神经元凋亡的作用明显增强，呈现出一定的剂量依赖性，这个结果与文献报道的［13］HDACi能够诱导培养的多巴胺能神经细胞凋亡的研究结果一致。表明在正常情况下丁酸钠对机体产生一定的损害作用。

在神经退行性疾病的发病过程中，HAT含量下降，乙酰化内稳态平衡打破。HDACi靶向作用于HDAC，主要通过抑制HDAC的活性使组蛋白乙酰化程度升高。HDACi能够提高组蛋白H3及H4的乙酰化水平，促进脑退行性病变动物恢复长时记忆和形成新记忆，巩固长时程增强，提高实验动物的学习记忆能力，改善神经退行性病变模型的症状。在亨廷顿病果蝇模型的研究中发现，特异性的抑制HDAC的活性能够阻滞疾病的进程［14］。苯丁酸钠是一种HDACi，能够纠正肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)小鼠异常基因的转录，与利鲁唑合用时，能够明显延长G93A转基因ALS小鼠的生存，改善临床和神经病理学表型［15］。本研究中，Western blot和RT-PCR实验结果显示，MPTP组、丁酸钠组与对照组相比，HDAC1的表达水平明显降低，MPTP+丁酸钠组HDAC1的表达较MPTP组明显升高，表明PD模型鼠组蛋白乙酰化内稳态发生失调，丁酸钠能够修复和维持PD模型鼠的组蛋白乙酰化的平衡状态。

综合上述研究结果，我们推测丁酸钠能够增加PD模型鼠TH的表达，保护多巴胺能神经元，从而改善PD模型鼠认知功能和情感障碍，这种作用机制可能是通过修复和维持组蛋白乙酰化的平衡状态来完成。因此详细阐明丁酸钠对PD模型鼠认知功能和情感障碍改善的具体机制，有望为未来中枢神经退行性疾病的治疗提供新的理论依据和方法，也为未来新一类治疗神经系统疾病药物的研究和开发提供新的靶点。

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