紫甘薯酒发酵工艺条件的优化

杨雅利，阚建全*，沈海亮，廖 晨，胡益侨

(西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400716)

紫甘薯酒发酵工艺条件的优化

杨雅利，阚建全*，沈海亮，廖 晨，胡益侨

(西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400716)

以四川达州生产的紫甘薯为原料，应用现代微生物发酵技术，通过单因素和响应面试验对紫薯酒的发酵工艺条件进行优化研究，从而确定紫薯酒发酵的最佳工艺参数。结果表明：对糊化过的紫甘薯进行打浆后，在pH值为6.5，α-淀粉酶添加量为0.15%，温度为65℃，酶解时间为2.5h的条件下进行液化；在pH值为4.0，糖化酶的添加量为0.15%，酶解时间为2.5h，温度为60℃的条件下进行糖化；然后再对紫甘薯酒调节pH值为3.355，添加0.0845%的安琪酿酒高活性干酵母，在温度20.72℃的条件下，发酵7d，即可得到酒度为10°左右的一种新型的紫薯发酵酒，其得率为126.3%。

紫甘薯；紫薯酒；响应面法；液化；糖化；发酵

紫甘薯是我国近年来从国外引进的红薯新品种，薯肉呈紫色至深紫色，学名是Solanum tuberdsm，科属是旋花科番薯属，又称为“黑薯、紫番薯、紫甘薯、紫心山芋”[1]。它的野生种起源于美洲热带地区，现全国广为栽培[2]。

紫肉甘薯除了具有普通甘薯的生理保健功能以外，还具有许多独特的保健药用价值。紫薯中纤维素的含量丰富，可增加粪便体积，促进肠胃蠕动，清理肠腔内滞留的黏液、积气和腐败物，排出有毒物质和致癌物质，保持大便畅通，改善消化道环境，防止胃肠道疾病的发生。另外，紫甘薯花色苷的主要成分是矢车菊

色素和芍药色素，具有较好的耐热性和耐光性，并且具有提高视觉灵敏性，抑制脂质过氧化，防止血小板聚集，维持血管正常的通透性，预防糖尿病以及抗肿瘤、抗突变和抗辐射等多种生理功能[3-8]。本研究以四川达州生产的紫色甘薯为原料，通过响应面法对紫薯酒的发酵工艺条件进行优化，确定紫色甘薯酒最佳的发酵工艺条件，并对优化后的结果进行验证，旨在为以后进行工业化生产提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫甘薯，产地四川达州，主要成分含量(%)：淀粉20.11、粗纤维0.78、蛋白质1.54、脂肪0.21、总灰分0.69、水分68.25、还原糖3.75，花色苷含量14.48mg/g。

α-淀粉酶(酶活力＞3700U/g)、糖化酶(酶活力＞105U/g) 北京奥博星生物技术有限责任公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 菌种

酿酒高活性干酵母 安琪酵母有限公司；法国拉曼酵母(D254) 上海杰兔工贸有限公司；酒用干酵母 广东省马利酵母有限公司。

1.3 仪器与设备

722-P可见分光光度计 上海现科仪器有限公司；SL602N型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；PHSJ-3F型酸度计 上海精密科学仪器厂；HH-W420数显三用恒温水箱 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；HH·B11·420-S-Ⅱ型恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；PSX-280A型手提高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；RE52-98型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。1.4方法

1.4.1 紫薯酒的制作工艺流程

紫甘薯→蒸煮糊化→打浆→调节pH值→α-淀粉酶酶解液化→调节pH值→糖化酶酶解糖化→调节pH值→加酿酒酵母→发酵7d→过滤→杀菌→紫甘薯酒

1.4.2 菌种的活化方法

将5%的干酵母，加入到含糖5%的糖水中，在温度38℃条件下，搅拌活化约15～30min，直至糖水中出现大量的小气泡为止。

1.4.3 紫甘薯的α-淀粉酶水解液化条件研究

在预实验基础上，对糊化过的紫甘薯以1:1.5的料液比进行打浆过后，用柠檬酸和NaOH调节pH值，加入α-淀粉酶进行液化，以水解度为指标，对温度、时间、pH值、α-淀粉酶添加量为影响因素，进行四因素三水平正交试验设计，因素水平设计见表1。

表1 α-淀粉酶酶解液化条件的正交试验设计方案Table 1 Coded values and corresponding real values of the liquification conditions tested in orthogonal array design

1.4.4 紫甘薯的糖化酶水解糖化条件研究

以1.4.3节最佳条件液化的紫甘薯液化料液为研究对象，用柠檬酸和NaOH调节pH值，加入糖化酶进行糖化，以还原糖含量为指标，以pH值、糖化酶添加量、时间、温度为影响因素，进行四因素三水平正交试验，其因素及水平设计见表2。

表2 糖化酶酶解糖化条件的正交试验设计方案Table 2 Coded values and corresponding real values of the saccharification conditions tested in orthogonal array design

1.4.5 紫甘薯酒发酵条件的单因素试验设计

1.4.5.1 酵母菌的选择

对于经过α-淀粉酶液化和糖化酶糖化过的紫甘薯液，调节其pH值为4.0，然后分别接种安琪酿酒高活性干酵母、马利酒用干酵母、法国拉曼酵母(D254)，酵母菌的添加量为0.1%，在温度为27℃的条件下，发酵7d后，比较其酒度和花色苷含量。

1.4.5.2 料液初始pH值的确定

对于经过α-淀粉酶液化和糖化酶糖化过的紫甘薯液，分别调节其pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，然后添加0.1%活化过的安琪酿酒高活性干酵母，在27℃条件下发酵7d后，比较其酒度和花色苷含量。

1.4.5.3 料液中酵母菌添加量的确定

对于经过α-淀粉酶液化和糖化酶糖化过的紫甘薯液，调节其pH值为3.5，分别添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%活化后的安琪酿酒高活性干酵母，在温度为27℃的条件下发酵7d后，比较其酒度和花色苷含量。

1.4.5.4 发酵温度的确定

对于经过α-淀粉酶液化和糖化酶糖化过的紫甘薯液，调节其pH值为3.5，添加0.1%的活化后的安琪酿酒高活性干酵母，分别在16、20、24、28、32℃温度条件下，发酵7d后，比较其酒度和花色苷含量。

1.4.6 响应面的试验设计

在单因素试验分析结果的基础上，采用三因素三水平的Box-Behnken响应面设计方法[9-12]，选择发酵初始pH值、酵母菌(安琪酿酒高活性干酵母)添加量和发酵温度这3个影响较大的因素进行响应面试验，以酒度为指标进行优化，所有试验均重复3次。试验因素水平设计具体见表3。

表3 Box-Behnken响应面试验设计因素水平Table 3 Coded values and corresponding real values of the fermentation conditions tested in Box-Behnken experimental design

1.5 指标测定方法

1.5.1 花色苷含量测定[13]

采用消光系数法，取1mL发酵酒液用酸化乙醇(95%乙醇-1.5mol/L盐酸体积比85:15)稀释，静置1h后测定A530nm和A720nm值。

1.5.2 常规指标测定

水解度：采用GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的测定》中的酸水解法；还原糖含量：采用GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》中的直接滴定法；pH值：采用pH计直接测定；酒度：采用GB/T 5009.48—2003《蒸馏酒与配制酒卫生标准的分析方法》中的比重计法，以乙醇的体积分数计。

1.6 数据统计与分析

利用SPSS 11.0、Excel 2007对单因素试验的数据进行处理。采用Design-Expert软件(Version 7.1 Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, USA)对响应面试验得到的数据进行线性回归和方差分析。

2 结果与分析

2.1 紫甘薯的α-淀粉酶酶解液化试验条件优化

表4 α-淀粉酶酶解液化条件的正交试验方案及结果Table 4 Orthogonal array design and results for optimizing liquification conditions

从表4可以看出，各个因素对α-淀粉酶水解紫甘薯液的影响顺序为A＞D＞B＞C，即温度对α-淀粉酶酶解紫甘薯液的影响最大，pH值的影响最小。α-淀粉酶酶解液化紫甘薯的最优组合为A1B1C2 D3，但是此组合在9组试验中未出现，因此需要做此组合的验证实验。在此最佳组合下，水解度为90.45%，在9组试验中最高。故α-淀粉酶酶解紫薯的最佳条件是：紫甘薯的料液比1:1.5(m/V)、温度65℃、水解时间2.5h、pH6.5、α-淀粉酶添加量0.15%。

2.2 紫甘薯的糖化酶酶解糖化试验条件优化

表5 糖化酶酶解糖化条件的正交试验设计结果Table 5 Orthogonal array design and results for optimizing saccharification conditions

由表5可知，糖化酶酶解影响因素最大的是糖化酶添加量，其次是pH值，然后是酶解时间，最后是温度。糖化酶酶解糖化的最佳组合为A2B3C1D3，由于该组合未在正交表中出现，因此需要再做此组合的验证实验，在此组合条件下得还原糖含量为11.35%，在9组试验中为最高。因此，确定糖化酶酶解糖化紫薯液的最佳条件：pH值为4.0，糖化酶添加量0.15%，酶解时间2.5h，温度60℃。

2.3 酵母菌的确定

图1 不同酵母菌对紫薯酒的酒度和花色苷含量的影响Fig.1 Effects of yeast type on alcohol and anthocyanin contents of purple potato wine

紫甘薯经2.1节和2.2节优选出的最佳液化和糖化条件处理后，在发酵初始pH值为4.0，酵母菌添加量为0.1%，发酵温度为27℃，发酵7d的条件下，分别采用不同品牌酵母发酵，测定发酵液的酒度和花色苷含量，结果见图1。利用安琪酿酒高活性干酵母发酵制得的紫薯酒的酒度较高，且花色苷的含量也较高，酒香味比较纯正，酸涩味和谐。

2.4 紫薯酒酵母发酵条件的单因素试验研究

2.4.1 料液初始pH值对发酵酒的酒度和花色苷含量的影响

以紫甘薯经2.1节和2.2节优选出的最佳液化和糖化条件处理后得到的料液为研究对象，分别调节其pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，再添加0.1%活化后的安琪酿酒高活性干酵母，在27℃的条件下发酵7d后，测定其酒度和花色苷含量，结果见图2。

图2 pH值对紫薯发酵酒的酒度和花色苷含量的影响Fig.2 Effect of pH on alcohol and anthocyanin contents of purple potato wine

由图2可知，料液的初始pH值为3.5时，发酵出的紫薯酒的酒度和花色苷的含量均最高。当pH＜3.5时，随着pH值的增加，紫薯酒的酒度逐渐升高；当pH＞3.5时，随着pH值的增加，紫薯酒的酒度逐渐降低。因此，料液的初始pH值以3.5为宜。

2.4.2 料液中安琪酿酒高活性干酵母添加量对发酵酒的酒度和花色苷含量的影响

图3 安琪酿酒高活性干酵母添加量对紫薯酒的酒度和花色苷含量的影响Fig.3 Effect of added yeast amount on alcohol and anthocyanin contents of purple potato wine

以紫甘薯经2.1节和2.2节优选出的最佳液化和糖化条件处理后得到的料液为研究对象，调节其pH值为3.5，分别添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%活化过的安琪酿酒高活性干酵母，在27℃条件下发酵7d后，测定其酒度和花色苷含量，结果见图3。当料液中安琪酿酒高活性干酵母的添加量为0.1%时，紫薯酒的酒度最高；当安琪酿酒高活性干酵母的添加量＜0.1%时，随着安琪酿酒高活性干酵母添加量的增加，紫薯酒的酒度逐渐升高；当安琪酿酒高活性干酵母的添加量＞0.1%时，随着添加量的增加，紫薯酒的酒度开始降低。因为当安琪酿酒高活性干酵母添加量小时，发酵液中的糖不能完全被安琪酿酒高活性干酵母利用转化为酒精；安琪酿酒高活性干酵母的添加量大时，会消耗紫薯发酵液中的糖用于自身的生长，而用于生成酒精的底物量减少。而安琪酿酒高活性干酵母的添加量对紫薯酒中花色苷的含量影响不是很大。

2.4.3 发酵温度对发酵酒的酒度和花色苷含量的影响

以紫甘薯经2.1节和2.2节优选出的最佳液化和糖化条件处理后得到的料液为研究对象，调节其pH值为3.5，添加0.1%活化过的安琪酿酒高活性干酵母，分别在16、20、24、28、32℃的温度条件下，发酵7d后，测定其酒度和花色苷含量，结果见图4。

从图4可以看出，当发酵温度为20℃时，紫薯酒的酒度和花色苷的含量都为最高；当温度＜20℃时，随着发酵温度的增加，紫薯酒的酒度和花色苷的含量都逐渐升高；当温度＞20℃时，随着发酵温度的增加，紫薯酒的酒度开始降低，而花色苷含量也有所降低，但是变化不是很大。因为温度会影响酵母菌的生长，温度过高时，酵母菌的发酵速度快，发酵剧烈，酵母菌衰老很快，最终生成的酒度低。

2.5 紫薯酒酵母发酵条件的响应面优化试验研究

2.5.1 紫薯酒酵母发酵条件的响应面设计及结果

根据单因素试验结果，选取各个因素的水平，经软件Design Expert 7.0设计Box-Behnken响应面设计试验因素水平，试验结果见表6。

表6 响应面试验设计及结果Table 6 Box-Behnken experimental design and results for optimizing fermentation conditions

通过软件分析，可以得到优化后响应值的动态参数方程：Y＝11.22ˉ0.47Aˉ0.51B＋1.04C＋0.35ABˉ 0.55ACˉ0.83BCˉ1.17A2ˉ1.25B2ˉ4.00C2。

2.5.2 回归分析

表7 回归模型的方差分析Table 7 Variance analysis for the fitted regression equation with alcohol degree as a function of various fermentation conditions

F检验反映的是回归模型的有效性，包括失拟性检验和回归方程显著性检验[14]。t检验是对回归模型的系数进行显著性检验。由方差分析可见，该模型的P＜0.05，表明该模型显著；失拟项在α＝0.05水平上不显著(P＝0.1125＞0.05)。该方程决定系数R2＝0.9766，说明建立的模型能理解响应值变化的97.66%，模型的拟合程度较好，模型是合适的。

由表7可以看出，A2、B2、C2对紫薯酒酒度的影响极显著(P＜0.01)；因素C对其影响极显著(P＜0.01)；因素B对其影响显著(P＜0.05)；BC交互作用对其影响显著(P＜0.05)；AB、AC交互作用对其影响不显著(P＞0.05)。

2.5.3 各因素交互作用的响应面图和等高线图

图5 pH值和安琪酿酒高活性干酵母添加量的交互作用对紫薯酒酒度影响的响应面和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of pH and yeast dose on alcohol content of purple potato wine

图6 pH值和温度的交互作用对紫薯酒酒度影响的响应面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactiveeffects of pH and temperature on alcohol content of purple potato wine

图7 安琪酿酒高活性干酵母添加量和温度的交互作用对紫薯酒酒度影响的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of yeast dose and temperature on alcohol content of purple potato wine

由图5～7可知，交互作用对响应值的影响结果可以直接的反映出来，等高线的形状反映了交互作用的强弱，椭圆表示交互作用显著，而圆形则表示交互作用不显著[15]。在交互作用对紫薯酒的酒度的影响中，安琪酿酒高活性干酵母的添加量和温度的交互作用较为显著。

2.5.4 回归模型的验证实验

经软件Design Expert 7.0优化，分析得到最佳的试验参数：pH值为3.355、安琪酿酒高活性干酵母添加量为0.0845%、发酵温度为20.72℃，进行验证实验，重复3次，测得紫薯酒的酒度为11.2°，与理论预测的最大值11.4616°基本相符，表明该模型可以很好的预测紫薯酒的发酵条件和酒度的关系。同时也证明了响应面法优化紫薯酒发酵工艺参数的科学性和可行性。

3 结 论

3.1 确定了紫薯酒发酵料液的酶解条件，淀粉酶的酶解液化条件：料液比1:1.5、pH6.5、α-淀粉酶添加量0.15%、温度65℃、酶解时间2.5h；糖化酶的酶解糖化条件：pH4.0、糖化酶添加量0.15%、酶解时间2.5h、温度60℃。

3.2 通过单因素和Box-Behnken响应面试验，利用统计学的方法建立了紫薯酒发酵条件的二次多项式模型：Y＝11.22ˉ0.47Aˉ0.51B＋1.04C＋0.35ABˉ0.55ACˉ 0.83BCˉ1.17A2ˉ1.25B2ˉ4.00C2。并且确定了紫薯酒发酵的最优条件：pH3.355、安琪酿酒高活性干酵母添加量0.0845%、发酵温度20.72℃，测得紫薯酒的酒度为11.2°，与预测值(11.4616°)接近，说明了该模型可以很好的预测紫薯酒的发酵条件与酒度的关系。同时也证明了响应面法优化紫薯酒发酵工艺参数的可行性。

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Optimization of Fermentation Conditions for Purple Potato Wine

YANG Ya-li，KAN Jian-quan*，SHEN Hai-liang，LIAO Chen，HU Yi-qiao
(Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China)

Purple potatoes from Dazhou, Sichuan province were used as raw material to ferment purple potato wine and the optimization of fermentation conditions was investigated by single factor experiments and response surface methodology. Gelatinized purple sweet potatoes were beaten into a slurry, liquified for 2.5 h with 0.15% α-amylase at 65 ℃ and pH 6.5, saccharified for 2.5 h with 0.15% glucoamylase at 60 ℃ and pH 4.0, and fermented for 7 days with 0.0845% Angel alcohol active dry yeast at 20.72 ℃ and pH 3.355. As a result, a novel purple potato wine of approximately 10°with a yield of 126.3% was obtained.

purple potato；purple potato wine；response surface methodology；saccharification；hydrolysis；fermentation

TS262.7

A

1002-6630(2012)03-0157-06

2011-03-28

四川省重大科技计划项目(2009NZ0077)

杨雅利(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：yangyali037581@126.com

*通信作者：阚建全(1965—)，男，教授，博士，研究方向为食品化学与营养学、食品生物技术。E-mail：ganjq1965@163.com