骨质疏松动物模型形态学与计量学研究及其应用

唐 利 王鸿度 陈 庄 (泸州医学院附属医院，四川 泸州 646000)

骨质疏松动物模型形态学与计量学研究及其应用

唐 利 王鸿度1陈 庄 (泸州医学院附属医院，四川 泸州 646000)

骨质疏松;形态学;计量学

骨质疏松是一种以骨量减少、骨组织微结构退行性变(松质骨骨小梁变细、数量减少、断裂;皮质骨多孔、变薄)为特征，以致骨脆性增加、骨折危险性增高的全身代谢性骨病〔1〕。随着人均寿命延长、老龄化社会的到来及骨质疏松并发症发病率的上升，研制各种防治新药、探寻多种治疗手段及其作用机制以改善患者生活质量变得越来越重要，如何准确检测与评价各种治疗后骨组织的发展动态又显得尤为重要，在众多检测与评价方法中，形态学与计量学方法对骨质疏松的防治研究有着极其重要的价值和意义。

1 骨质疏松动物模型

由于骨质疏松为慢性病，而骨活检为有创性，存在一定痛苦，难以被患者接受，故直接对人体骨组织进行形态学与计量学研究存在一定困难，动物模型作为一种替代手段有着极其重要的作用。用于骨质疏松的模型动物有大鼠、小鼠、犬、兔、猪、羊、狒狒、猴等〔2〕，选择时以能最大程度复制人骨质疏松特点、重复性好、便于操作且经济有效为标准，目前大鼠应用最多。造模方法有去势法、制动失用法、糖皮质激素及维甲酸灌胃诱导法等〔3，4〕，其中在1969年由Savile建立的去势大鼠骨质疏松模型，经反复证实，被公认为复制骨质疏松的“经典病理模型”。选择骨骼与性接近成熟的6月龄大鼠去势后造模较适合，也有人认为选择6～9月龄大鼠也能达到理想的复制效果〔5〕。

2 骨质疏松形态学研究及其应用

2.1 标本的制备 处死动物前第11、12天和第2、3天需分别皮下注射盐酸四环素和钙黄绿素(Calcein)行荧光双标记，以利于骨动态参数的测量〔6〕。

骨质疏松主要发生在松质骨，如长骨干骺端和椎骨，以胫骨为例，取左、右胫骨近端1/3，分别沿纵、横切面锯开后固定脱水。由于常规脱钙会使骨组织丢失约2/3左右的钙盐，组织形态严重形变，不能准确评估骨的真实情况：骨小梁结构遭到破坏，难于进行形态学计量，导致骨生长与钙化方面的信息丢失;骨细胞表面抗原受损丢失严重，不利于进行免疫组化检测〔7，8〕。采用李朵等〔8〕对Erben甲基丙烯酸甲酯(MMA)低温塑料包埋法(简称旧法)改良后的不脱钙包埋新法，不仅简化了包埋，且克服了上述难题。包埋后用硬组织切片机切成约8 μm的厚骨片(测量松质骨动态参数)和5μm的薄骨片(测量松质骨静态参数)〔6〕。厚骨片直接透明封片后荧光显微镜下观察，测量单、双标记荧光线长、宽等。薄骨片则可根据想要了解的不同骨细胞的情况和骨组织的某些结构选取不同的染色方法：①Masson-Goldner Trichrome染色〔9〕，骨小梁中骨细胞胞浆红染;骨小梁绿色，其边缘未矿化类骨质红染，二者界清;破骨细胞与成骨细胞胞浆橘黄色，胞核灰蓝等。该染色法为观察骨小梁表面破骨细胞数和测量其周长骨小梁图像分析的最佳方法〔10〕。②甲苯胺蓝染色常用于测量骨小梁厚度及宽度、骨壁厚等。③奥新蓝染色使小梁骨钙化软骨轴呈紫红色，通过测量分析其周长、面积及光密度等，可大致明确其成熟度〔11〕。④Dahl-McGee-Russell茜素红S和Von Kossa染色，可清晰显示组织内钙盐，前者显示钙化点及钙化局部，后者显示钙盐沉着量〔10〕。⑤Giemsa法和亚甲基蓝一碱性品红更适用于观察成骨细胞，Goldner'S三色法用于区分骨矿化的不同阶段及显示成骨更具优势〔12〕。⑥苦味酸天狼猩红染色偏振光检测法〔13〕可对骨胶原进行分析测定及分型。

2.2 免疫组化及原位杂交 随着骨质疏松等骨代谢性疾病基础研究地不断深入，对其发病及治疗分子机制的研究已越来越多。在分子病理学研究中，免疫组化和原位杂交技术已相当成熟并被广泛应用〔9〕，不脱钙骨组织包埋技术的不断改进更促进了其在骨组织研究领域的应用。研究表明〔9〕，多种细胞因子参与骨质疏松的发生，如胰岛素样生长因子(IGF-1)、基质金属蛋白酶(MMPs)、骨形态发生蛋白(BMP)等。咎强等〔14〕用免疫组化法对强骨颗粒治疗骨质疏松大鼠后骨组织中TGF-β1表达水平进行检测，探讨其对骨代谢产生的影响。李剑等〔9〕、李朵等〔15〕采用免疫组化和原位杂交技术分别检测了骨组织细胞中IGF-1、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)mRNA和蛋白表达。雌激素在维持骨吸收与骨形成的平衡中发挥重要作用，该观点已得到证实与广泛认同，雌激素受体(ER)在破骨细胞和成骨细胞中均存在〔16〕，通过免疫组化技术检测ER，对深入研究雌激素对骨质疏松的影响机制有重要意义。该技术已成为检测骨组织中多种细胞因子表达水平改变的重要手段，为骨质疏松等代谢性骨病的分子病理学研究提供了有效技术平台。

3 骨形态计量学研究及其应用

单纯的骨形态学只能定性不能定量，骨形态计量学的发展弥补了这一不足。骨形态计量学是一种基于体视学原理，在硬组织切片二维图像上推导出可反映骨量、骨结构、骨重建等三维结构的方法〔17〕。Parfitt等〔18〕对其相关术语、符号及单位制定了统一的标准，随着骨计量学的发展，采用半自动数字化图像分析系统和测量软件更便于定性、定量测量计量学参数，如骨小梁表面积、平均骨小梁厚度、骨小梁宽度、骨小梁分离度、平均类骨质宽、平均类骨质表面、平均类骨质体积、破骨细胞活跃表面、成骨细胞活跃表面、平均骨壁厚等;四环素等荧光标记物可与骨特异性结合并沉积在其矿化前沿，通过活体荧光标记，可在骨重建过程中体现时间因素，从而测定多组骨动力学参数〔19〕。测量范围一般在距骺线近端1 mm至远端4 mm的区域内〔20〕。

骨计量学动态参数包括：骨吸收参数一破骨细胞周长百分率(%Oc.Pm)、单位骨小梁面积上的破骨细胞数(Oc.N)等;骨形成参数一矿化沉积率(MAR)、荧光标记周长百分数(L.Pm%)、单位骨小梁面积骨形成率(BFR/Bv)、单位骨小梁周长骨形成率(BFR/BS)等〔21〕。静态参数包括：反映骨结构的参数一骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁宽度(Tb.Wi);反映骨量的参数一骨小梁面积百分数(%Tb.Ar)。

目前国内外对骨质疏松的研究多集中在松质骨，这主要是由于皮质骨发生骨质疏松过于缓慢且不明显，但皮质骨占长骨骨量的80%，不仅决定着骨的结构和形态，对骨功能完善程度也起关键作用〔6〕;Vilimaki等〔21，22〕也指出，骨质疏松发生时，除骨小梁骨量明显减少外，皮质骨骨量也减少，因此不应忽视对皮质骨的观察。Okumura〔23〕等发现去势联合糖皮质激素法造模能加快皮质骨骨丢失，可见，多种方法联合造模对皮质骨的研究有重要意义。皮质骨动态参数包括皮质骨内膜荧光标记周长百分数(%E-L.Pm)、皮质骨内膜面骨形成率(E-BFR)、皮质骨外膜面荧光标记周长百分数(%P-L.Pm)、皮质骨外膜面骨形成率(P-BFR)和皮质骨内膜面骨吸收周长百分数(%Er.Pm)。

近年来，骨计量学广泛用于骨质疏松等代谢性骨病发生机制、药效学及各种防治手段的研究。Rude等〔24〕研究元素镁对骨的影响时发现，与饲料中镁充足的对照组相比，饲料中镁缺乏组大鼠其单位骨小梁面积上成骨细胞数、破骨细胞数、破骨细胞活跃表面均增加，骨小梁面积百分数降低，可见镁缺乏对骨质疏松的形成有促进作用。梁晓萍等〔25〕在探讨甲状旁腺激素1-34(hPTH1-34)对骨质疏松的治疗作用时发现，hPTH1-34治疗后，大鼠胫骨矿化沉积率、骨小梁面积增加明显，可见hPTH1-34对骨质疏松有治疗作用。Vahle等〔26〕观察不同剂量重组人甲状旁腺激素1-34(rhPTH1-34)对大鼠骨各项指标的影响时发现，当用药剂量为75 μg/kg左右时，不同时段大鼠骨髓腔面积相对较小，皮质骨面积、小梁骨面积和平均皮质骨厚度相对较大，这为该药用于临床的有效性、安全性及最适用药量的选择提供了参考。李福安等〔27〕在应用周围神经功能性电刺激防治大鼠骨质疏松的实验中发现：骨形成参数-矿化沉积率、骨形成率增加;骨吸收参数-骨吸收周长百分数增加;骨结构-骨小梁数量及厚度均减少、分离度增加;高转化参数-激活频率显著增加，这为电刺激法用于防治骨质疏松提供了佐证。骨质疏松的发生发展为一慢性过程，中药调理对其防治有重要作用，很多学者对强骨颗粒、骨灵片、仙灵骨葆等中药的疗效进行了研究，通过对破骨细胞与成骨细胞数量、形态及活性、骨结构形态与数值、骨量改变及骨转换率等信息的分析，判断骨重建的不同阶段，为多种中药防治骨质疏松的有效性提供有力依据。

骨质疏松检测方法众多，如骨密度、影像学、生物力学、形态学与计量学、生化等检测，虽然骨密度检测为目前临床诊断、动物模型评价、药效评估的常用方法，但只有骨量发生明显变化时才能反映出来，灵敏度低、重现性差〔28〕。有研究表明〔29〕，骨形态学变化先于骨密度、生物性能和血、尿生化等的变化，提示骨质疏松发生过程中，形态改变可能早于性能改变。因此，观察药效、评估各种防治手段等须更重视形态学改变。骨形态学结合骨计量学使得形态学改变与机能定量检测能够准确的予以揭示，再联合骨密度等多项检测，可全面了解骨病理生理改变与功能变化，为准确诊断骨质疏松、评价药效、评估防治新手段等提供理论依据。

1 No authors listed.Consensus development conference：diagnosis，prophylaxis and treatment of osteoporosis〔J〕.Am J Med，1993;94(6)：646-50.

2 刘钰瑜，吴 铁，王 晖.骨质疏松动物模型的研究进展〔J〕.中国临床药理学与治疗学，2002，7(2)：570-2.

3 Jee WS，Yao W.Overview：animal models of osteopenia and osteoporosis〔J〕.J Musculoskel Neuron Interact，2001;1(3)：193-207.

4 冯秉玮，高雨仁，杨桂娇.维甲酸致雌性大鼠骨质疏松的形态学实验研究〔J〕. 包头医学院学报，2004;20(4)：271-3.

5 郑良朴，李远志，胡海霞，等.不同月龄大鼠去卵巢骨质疏松模型的比较〔J〕. 福建中医药，2009;40(2)：50-1.

6 张延娇，李绍新，陈 博.哌嗪雌酚酮对生长期去卵巢小鼠胫骨骨形态计量学的影响〔J〕.广东医学院学报，2010;28(2)：125-8.

7 张双燕，谢幼专，薛文东，等.塑料包埋技术在骨组织研究中的应用〔J〕.现代临床医学生物工程学杂志，2006;12(5)：430-2.

8 李 朵，魏启幼，范青松，等.不脱钙骨组织包埋技术的改进〔J〕.临床与实验病理学杂志，2005;21(6)：731.

9 李 剑，廖二元，魏启幼，等.不脱钙骨组织免疫组织化学与原位杂交的方法研究〔J〕.湖南医科大学学报，2003;28(6)：601-4.

10 吕 荣，王 军，徐新智，等.塑料包埋非脱钙骨技术在骨组织学与图像分析中的应用〔J〕.临床与实验病理学杂志，2006;22(3)：369.

11 李 莉，张 平，沈乾一，等.实验性骨质疏松大鼠胫骨髁病理变化的图像分析研究〔J〕.中国骨伤，2003;16(12)：719-22.

12 王东胜.三种特殊染色法显示不脱钙骨切片中新生骨的比较研究〔J〕. 中华老年口腔医学杂志，2006;4(3)：139-40.

13 汪 青，孙 兰，龚海洋，等.骨质疏松动物模型建立与评价〔J〕.中国药理学通报，1999;15(5)：392-3.

14 咎 强，陈世柱，王勇刚.强骨颗粒对骨质疏松症大鼠血清中IGF-1、TGF-β1及骨形态计量学的影响〔J〕. 陕西中医，2009;30(12)：1669-70.

15 李 朵，魏启幼，袁凌青，等.人类不脱钙骨组织的免疫组化与原位杂交〔J〕.中国骨质疏松杂志，2006;12(2)：159-62.

16 张晓丽.雌激素在骨髓间充质干细胞中的表达和作用〔J〕.四川生理科学杂志，2010;32(3)：131.

17 刘忠厚.骨矿与临床〔M〕.北京：中国科学技术出版社，2006：353-6.

18 Parfitt AM，Drezner MK，Glorieux FH，et al.Bone Histomorphometry：Standardization of Nomenclature，Symbols，and Units〔J〕.J Bone Miner Res，1987;2(6)：595-608.

19 Vincent A，Fitzpatrick LA.Soy isoflavone：are they useful in menopause?〔J〕.Mayo Clin Proc，2000;7(5)：1174-84.

20 刘晓青，崔 燎，吴 铁.双侧卵巢切除大鼠不同时间段骨形态计量学参数的观察〔J〕.中国骨质疏松杂志，2005;11(4)：428.

21 Vilimaki MJ，Tahtela R，Jones JD，et al.Bone resorption in healthy and osteoporotic postmenopausal women〔J〕.Eur J Endocrinol，1994;131(3)：258-67.

22 Marie PJ.The molecular genetics of bone formation：implications for therapeutic interventions in bone disorders〔J〕.Am J Pharmacogenomics，2001;1(3)：175-87.

23 Okumura H，Yamamuro T，Kasai R，et al.Effect ofα-hydroxyvitamin D3 on osteoporosis induced by immobilization combines with ovariectomy in rats〔J〕.Bone，1987;8(6)：351-5.

24 Rude RK，Gruber HE，Norton HJ，et al.Bone loss induced by dietary magnesium reduction to 10%of the nutrient requirement in rats is associated with increased release of substance P and tumor necrosis factor-α〔J〕?J Nutr，2004;134(1)：79-85.

25 梁晓萍，戴 勇，文锦丽，等.甲状旁腺素1-34对骨质疏松大鼠治疗作用的实验研究〔J〕.中国老年学杂志，2005;7(25)：802-3.

26 Vahle JL，Sato M，Long GG，et al.Skeletal changes in rats given daily subcutaneous injections of recombinant human parathyroid hormone(1-34)for 2 years and relevance to human safety〔J〕.Toxicol Pathol，2002;30(3)：312-21.

27 李福安，李 全，文 宁.周围神经功能性电刺激防治大鼠实验性骨质疏松的骨形态计量学研究〔J〕.中医正骨，2002;14(6)：3-4.

28 吴 波.骨质疏松症动物模型研究的现状与展望〔J〕.药学学报，1996;31(4)：316-20.

29 赵 烨，杨亚军，马世平，等.去势大鼠骨形态计量学、生物性能变化〔J〕. 北京生物医学工程，2007;26(2)：194.

R331

A

1005-9202(2012)17-3851-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.130

国家中医药管理局科研专项课题(No.06-07JP40);四川省科技厅科研专项课题(No.2009JY0127)

1 泸州医学院附属中医院

陈 庄(1954-)，男，博士后，教授，主要从事免疫病理学研究。

唐 利(1986-)，女，技师，主要从事实验病理学研究。

〔2011-07-19收稿 2011-11-15修回〕

(编辑 赵慧玲)