蜜蜂蜂王不同于工蜂的关键因素-蜂王浆主蛋白1

柳丹丹，肖 发，杨晓丽，李玫璐，曾艳军，于张颖，沈立荣，*，裘 卫，尹志红

(1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310058;2.杭州碧于天保健品有限公司，浙江杭州311500)

蜜蜂蜂王不同于工蜂的关键因素-蜂王浆主蛋白1

柳丹丹1，肖 发1，杨晓丽1，李玫璐1，曾艳军1，于张颖1，沈立荣1，*，裘 卫2，尹志红2

(1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310058;2.杭州碧于天保健品有限公司，浙江杭州311500)

蜂王浆是决定蜜蜂幼虫发育中级型分化，即成为蜂王还是工蜂的关键环境因素，而蜂王浆主蛋白(main royal jelly proteins，MRJPs)是反映蜂王浆新鲜度的重要指标。日本镰仓昌树以蜜蜂和果蝇为模型的最新研究表明，MRJP1是蜂王浆中决定蜜蜂级型分化的关键因子，该蛋白可通过激活虫体脂肪体中的表皮生长因子信号通路，引发个体增大、发育时间缩短和卵巢发育等蜂王特征的出现。因此，今后很有必要进一步开展MRJP1对人体的营养功能和作用机理研究，为MRJP1应用于功能食品提供科学依据。

蜜蜂，蜂王浆，蜂王浆主蛋白1(MRJP1)，级型分化

Abstract:The royal jelly(RJ)is the critical environment factors of caste determination，becoming worker or queen in development for honeybee larvae.Main royal jelly proteins(MRJPs)are the important quality index revealed RJ fresh level.According to Kamakura’s new discovery with honey bee and Drosophila as models，MRJP1 was the critical factors of caste determination in honeybee.The appearance of the characters of queen，such as increasing of body weight，decreasing of developmental time and ovary development appeared were caused by activating an epidermal growth factor receptor(Egfr)signaling pathway in fat body.Therefore，it was essential to further study the nutritional functions and mechanism of MRJP1 in human in future，which will provide knowledge for the protein to be applied in functional foods.

Key words:honeybee(Apis mellifera);royal jelly;main royal jelly protein 1(MRJP1);cast differentiation

级型是指在社会性昆虫群体中，同一性别具有不同的形态、身体结构、职能和行为的个体类型。蜜蜂有三个级型:雄蜂、蜂王和工蜂。雄蜂为单倍体，由未受精卵发育而来;蜂王和工蜂都是由受精卵发育而成，遗传基因完全相同，但由于发育环境及营养的差异而产生不同级型的分化，使两者在形态、生理、行为等方面有明显差异［1-2］。不同的营养条件或差异性饲喂是引发蜂王和工蜂幼虫发育命运根本改变的基础，其中蜂王浆(royal jelly)是蜜蜂级型分化的关键，且可能含有一种决定级型分化的特别因子，但这种特别因子以前尚未鉴定;此外，蜂王浆对蜜蜂级型分化的作用机理也不清楚［2-3］。日本富山县立大学镰仓昌树的最新研究发现:royalactin，即蜂王浆主蛋白 MRJP1(main royal jelly protein 1，MRJP1)是蜜蜂级型分化的决定性因子［3］。本文结合相关背景和文献就此作一专题介绍和述评。

1 蜂王浆对蜜蜂的主要生理功能

蜂王浆是蜂群中5～15日龄期哺育工蜂的咽下腺、上颚腺和脑后腺等腺体的分泌物，是决定蜜蜂幼虫发育过程中级型分化的关键环境因素，其生理功能主要表现在三个方面:

第一，决定个体的级型分化和发育速度。哺育蜂能够区分两种不同的巢房，给予幼虫不同质和量的食物。王台容积比工蜂房要大得多，王台内的幼虫被连续饲以过量王浆，整个幼虫期间都以王浆为食，且被饲喂次数比工蜂幼虫多10倍以上，因此发育快、蛹期短，从卵到羽化只用16d时间，比工蜂少5d，其生殖系统及相应的器官发育充分，羽化后成为蜂王;而工蜂房内的幼虫孵化后3d内吃的是成分与王浆不相同的工蜂浆，之后取食的主要是蜂蜜和花粉的混合物，浆量少，因此工蜂幼虫比王台内的幼虫生长慢，其幼虫期延长到6d，蛹期延长到12d，到21d后方羽化为成虫，其个体发育周期比蜂王多了5d。这说明幼虫食物的质和量对级型分化有决定性作用，而且是以其特定的培养环境为基础的［1］。据刘光楠等最新观察，1只蜂王幼虫在生长发育期平均消耗196.8mg蜂王幼虫食物，比工蜂幼虫的食物消耗量增加41.2%(1只工蜂幼虫在生长发育期平均消耗139.4mg 工蜂幼虫食物)［4］。

第二，决定个体的寿命和生殖机能，使蜂王具有较长的寿命和旺盛的生殖能力。蜂王的寿命一般有1年以上，最长的达8年;而工蜂在生产季节只能存活50d左右，即使在半冬眠的越冬期最多也只能活11个月，蜂王寿命是工蜂的10～30倍。在繁殖季节，蜂王可不停地产卵，最盛时1d可下2000粒卵，卵的总重量相当于蜂王的体重，而工蜂则不具生殖功能［5-6］。

第三，决定个体的外部形态和内部解剖结构。如工蜂有蜡腺而蜂王没有，蜂王的上颚腺分泌物能抑制工蜂的卵巢发育，而工蜂上颚腺的主要功能是分泌报警信息素等。蜂王卵巢发育完全，而工蜂卵巢发育不全，只有无功能的受精囊和交配囊，其个体也比蜂王小约50%，羽化时体重比蜂王的轻得多。二者后足分化明显，工蜂拥有花粉篮结构，蜂王则无［7］。

蜂王和工蜂的遗传基因完全相同，但由于发育环境及营养的差异而产生不同级型的分化，它们的发育进度、体型、寿命和生殖力就出现如此巨大的差异，使人们感到非常神秘，促使科学家们乐此不疲地进行长期研究和探索;并推测蜂王浆可能对人类也具有营养和生理调节功能，进行了蜂王浆作为药品、功能食品、营养补充剂和化妆品的研究开发［8］。

2 对蜂王浆中关键活性成分的认识

显然，蜂王浆的功能源于所含生物活性成分。已知蜂王浆含水分60%～70%、蛋白质12%～15%、碳水化合物10%～16%、脂类3%～6%、10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decanoic acid，10-HDA，王浆酸)1.4%～2.0%以及类固醇激素、维生素、游离氨基酸等［7］，王浆酸是蜂王浆特有的活性成分。蛋白质约占蜂王浆干物质的50%，由水溶性蛋白和非水溶性蛋白组成，水溶性蛋白占总蛋白含量的46%～89%，为王浆蛋白的主要部分，称为主要王浆蛋白(major royal jelly proteins，MRJPs)。MRJPs约占水溶性王浆蛋白的 90%［8-9］。

近十年多来，蜂王浆中的活性蛋白和多肽成为研究热点。2006年10月西方蜜蜂(Apis mellifera)基因组分析结果公布，该研究的九项成就之一就是确定MRJPs是一个分子量范围在25～87ku的家族-MRJP/Yellow protein family，该家族拥有9个成员(MRJP1～MRJP9)［10］。MRJPs 家族来自于在果蝇中发现的同一个祖先Yellow-e3蛋白，各成员间具有高度的序列同源性，同时也具备一些相同的结构:均有四个保守的半胱氨酸位点，序列中存在一些几乎完全相同的氨基酸区域，C末端均具有高度疏水的特征性结构［11］。MRJPs包含大量必需氨基酸，在蜜蜂营养中具有重要作用。其中分子量为57ku的MRJP1是王浆蛋白中含量最丰富的糖蛋白，占MRJPs的48%。已知西方蜜蜂MRJP1 cDNA的编码序列为1430bp，编码的蛋白含432个氨基酸残基的蛋白，蛋白的N端含有一个由19个氨基酸残基组成的信号肽，含有 Asn28、Asn144、Asn177这 3 个糖基化位点。MRJP1蛋白含有20%的α螺旋和β折叠［10-12］。

MRJP1在王浆中以三种形式存在:单体、寡聚体以及和脂肪酸交互作用后形成的水不溶性的聚合体。MRJP1单体大小约为47ku，一般以与Apisimin结合的形式存在［13］，Apisimin 大小约为 5.5ku，是 54个氨基酸的小肽［14-15］。最早报道的MRJP1寡聚体是Apisin，其大小为350ku，它具有刺激人单核细胞增殖的活性［16］。目前已确定，MRJP1糖蛋白的聚合体是分子量为420ku的apalbumin-1，该名词的取名是考虑到MRJP1的性质类似于白蛋白albumin，再加上蜜蜂的缩写ap。Apalbumin-1和小肽apisimin(5.5 ku)的低聚体组成分子量为450ku的聚合蛋白。Simuth等已用光学显微镜和扫描电镜观察到了apalbumin-1的中MRJP1聚合体的显微结构［18-19］。MRJP1在蜂王浆中以分子量为57ku的单体糖蛋白存在，它的结构不同于apalbumin-1，能识别MRJP1的多克隆抗体不能识别 apalbumin-1，表明 MRJP1不可能由apalbumin-1衍生而来，为此，镰仓昌树将MRJP1命名 为 royalactin(royaljelly derived，hepatocyteactivating protein)［3］。

各国学者对MRJP1的功能和特性作了一系列研究。镰仓昌树等针对鲜王浆能使小鼠运动后改善生理疲劳的功能，进行了组分与功能关系分析。他们发现，在40℃下贮存了7d的蜂王浆无抗疲劳功能，经检测证实蜂王浆中的MRJP1被降解，而维生素、王浆酸和其他脂肪酸含量均未发生改变，从而推测蜂王浆对小鼠的抗疲劳作用与其新鲜度，即MRJP-1的含量有关［20-22］。随后，他们在MRJP-1对原代培养的大鼠肝细胞的生理影响研究中发现，在无血清培养基中，MRJP1蛋白能显著刺激肝细胞的DNA合成和白蛋白的产生，显示促进细胞分裂因子活性，其促细胞分裂活力具有剂量效应，浓度越高活力越强［23-24］。Majtan等发现，在大肠杆菌中重组表达的MRJPl具有促进鼠吞噬细胞释放肿瘤细胞坏死因子TNFα，提高肝细胞的增殖作用;在有充足血清的媒介中能刺激人淋巴细胞生长［25］。Yamaguchi等通过王浆酸、粗蛋白、MRJP1与蜜蜂幼虫生长关系观察，发现MRJP1是促进幼虫生长的关键蛋白，且两者呈剂量依赖关系，因此他们在2008年第九届亚洲养蜂大会上建议将MRJP1作为蜂王浆质量评价指标［26］。目前捷克学者已开发出用MRJP1多克隆抗体ELISA快速检测蜂王浆质量的方法［27］。

3 MRJP1是促使蜜蜂级型分化的关键因素的最新发现

3.1 MRJP1对蜜蜂级型分化和果蝇发育的作用

镰仓昌树以鲜蜂王浆和经40℃贮存7、14、21和30d的蜂王浆分别喂养蜜蜂幼虫，结果只有鲜蜂王浆喂养的蜜蜂幼虫发育成为蜂王，其余经贮藏的蜂王浆会减慢幼虫的生长速度，使新羽化的成虫体重减轻、卵巢体积缩小、预蛹发育时间延长，且这些参数与蜂王浆的贮存时间成正比。经40℃贮存30d的蜂王浆饲养的雌蜂发育成为工蜂。然后，他将蜂王浆在4℃和40℃分别贮存30d，再分别测定样品中维生素、王浆酸、碳水化合物和脂肪酸含量。结果显示，在40℃条件下贮存30d的蜂王浆中泛酸含量减少了60%，而其他成分无显著性变化。但泛酸对蜜蜂幼虫发育为蜂王并无影响［28］。然后用HPLC和非变性丙烯酰胺凝胶电泳分析40℃条件下贮存30d的蜂王浆中蛋白含量，结果发现，分子量为 450(即apalbumin-1与Apisimin的聚合体)、170和57ku(即MRJP1)的蛋白在贮藏过程中被降解了。170ku的蛋白40℃贮藏14d就完全分解，但此时的蜂王浆仍然能够影响卵巢和幼虫生长，故判定170ku蛋白与蜜蜂级型分化无关。MRJP1在40℃贮藏过程中逐步被分解，在30d时全部被降解，而apalbumin-1在30d时只有10%被降解。再测定apalbumin-1，MRJP1对蜜蜂级型分化的影响，和对照酪蛋白相比较，用40℃贮存30d的蜂王浆喂养的实验组最终发育出的蜜蜂的个体大小、发育时间以及卵巢大小没有改变。但是在40℃贮存30d的蜂王浆中加入MRJP1能够缩短蜜蜂的发育时间，并增加新羽化的蜜蜂成虫的体重和卵巢体积，且加入的MRJP1越多，增大的趋势越明显，当质量浓度为2%时能与蜂王浆同样，可诱使蜜蜂四龄幼虫发育成为蜂王。最后，采用大肠杆菌表达的重组MRJP1(分子量为47ku的E-royalactin)喂养蜜蜂幼虫，出现了类似鲜王浆的结果。而用apalbumin-1和酪蛋白喂养的蜜蜂幼虫没有产生这种效果。以上结果显示，MRJP1对蜜蜂级型分化的影响不仅是营养上的，也是形态上的，MRJP1是蜂王浆中诱导蜜蜂发生级型分化的主要功能因子。

用含20%蜂王浆、8%酵母和10%D-葡萄糖的饲料饲喂果蝇(Drosophila melanogaster)，在摄入能量相等的前提下，与对照饲料或加入酪蛋白的饲料相比，添加蜂王浆组果蝇的个体增大(包括体重以及体长)，繁殖能力增强，寿命延长，发育时间缩短。同时，与用40℃贮存30d蜂王浆喂养的果蝇相比，用MRJP1饲喂果蝇能增加个体大小、增大细胞体积、增强繁殖能力，延长寿命并缩短发育时间，而这些形态上的变化在用450ku蛋白和酪蛋白饲养时观察不到，上述结果与用MRJP1诱导蜜蜂幼虫发育成为蜂王的实验结果一致，这说明该蛋白对生物特征的影响是跨物种的［3］。

3.2 MRJP1对蜜蜂级型分化的作用机理

由于蜂王浆对果蝇表现出类似于蜜蜂的功能，镰仓昌树测定了蜂王浆对果蝇的胰岛素受体(insulin receptor，InR)突 变 体 (InRE19/InRE19和 InRp5545/InRE19)、前胸腺和侧咽体上携带有P0206-Gal4基因的1-磷脂酰肌醇3-激酶高活性突变体、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，Egfr)突变体(Egfrtsla/Egfrf24)个体大小的影响。结果相对于空白或者加入酪蛋白的饲料组，用含蜂王浆的饲料饲喂的InR突变体和P0206＞dPI3K突变体，能增大体型和缩短发育时间，但对Egfr突变体果蝇的个体大小与发育时间无影响。进一步实验结果表明，用蜂王浆或者MRJP1喂养果蝇产生的体重增加和发育时间缩短现象与脂肪体中的Egfr信号通路有关:通过脂肪体中的表皮生长因子受体激活控制身体个体增大的p70S6激酶(p70S6 kinases，p70S6K)，通过增大细胞大小增大果蝇体型;通过脂肪体中的Egfr促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activation protein kinases，MAPK)，激活脂肪体中的细胞外调节蛋白激酶通路来缩短果蝇发育时间。转基因果蝇实验发现过量表达MRJP1能活化幼虫脂肪体内的MAPK、S6K，而这种激活作用能被果蝇Egfr RNAi抑制，转基因果蝇由于Egfr信号通路受阻，导致体型与细胞大小的增加、发育时间缩短被抑制，结果与用蜂王浆喂养果蝇的效果一致［3］。

为研究MRJP1诱导果蝇形态和生理变化与激素调控的关系，镰仓昌树测定了喂蜂王浆的果蝇幼虫的20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(juvenile hormone，JH)生物合成量的变化，以及幼虫成长阶段卵黄蛋白基因表达产物的变化。20E能缩短果蝇发育时间，JH和卵黄蛋白的基因表达产物能促进果蝇产卵量。蜂王浆和MRJP1可提高排卵后3d果蝇的20E滴度、排卵后4d的JH和卵黄蛋白基因表达量。转基因果蝇实验表明，20E、JH、卵黄蛋白基因表达产物均与Egfr信号通路有关。20E的合成由Egfr的MAPK下游激活。且MRJP1激发的脂肪体Egfr信号通过了一条区别于调节个体大小和发育时间的路径，即增加JH合成，最后增加卵黄蛋白的表达，在这些改变的基础上来增强繁殖能力［3］。

为了确认这个信号通路与级型分化有关，他们再分别喂养了用InR RNAi和Egfr RNAi的蜜蜂幼虫。与对照组相比，Egfr RNAi组可缩小成虫卵巢大小、延长发育时间，但InR RNAi组不能。这种Egfr RNAi对蜂王级型分化的抑制在用MRJP1喂养的蜜蜂个体中也能发现。MRJP1像蜂王浆一样通过幼虫脂肪体中的Egfr激活MAPK和S6K。这些结果表明，MRJP1对Egfr的激活作用在蜜蜂的级型分化中是存在的。用RNAi干扰蜜蜂PI3K、PDK1、TOR和S6K能抑制用蜂王浆喂养蜜蜂引起的个体增大，但是不影响发育时间的变化和卵巢发育。蜂王浆或MRJP1能增加用40℃贮存30d的蜂王浆喂养的3日龄蜜蜂幼虫的20E滴度、JH滴度和卵黄蛋白原(vitellogenin，vg)基因表达产物，以及卵黄蛋白前体，但apalbumin和酪蛋白不能。用蜂王浆饲养的蜜蜂幼虫的20E表达量会受到Egfr RNAi、一种MAPK抑制体PD98059的抑制，但不会受S6K RNAi的抑制。用蜂王浆饲养的蜜蜂幼虫的JH和卵黄蛋白表达量受到 Egfr RNAi抑制，而不会受 S6K RNAi和PD98059的抑制。以上实验结果表明，MRJP1通过激活Egfr下游的MAPK，促进20E的生物合成，从而缩短蜜蜂幼虫的发育时间。向工蜂幼虫最大量地施用JH会导致类似蜂王的卵巢发育，但成虫个体大小与工蜂一致，因此 MRJP1通过激活 Egfr，促进 JH pfu/μL增加，最终促进了蜂王卵巢的发育。这种作用机制与MRJP1饲养的果蝇形态与生理变化机制是一致的［3］。

蜂王浆经40℃贮存30d apalbumin-1蛋白仅降解10%，且向其加入apalbumin-1并不能诱导蜂王的产生，也不增加蜂王的出现率。但是MRJP1和用大肠杆菌表达重组的MRJP1均能诱导蜜蜂的级型分化，因此，只有单体MRJP1才是蜜蜂级型分化作用的影响因子。MRJP1通过 Egfr延长果蝇寿命，说明MRJP1可能对延长蜂王寿命发挥重要作用。这是第一次有证据证明Egfr与寿命调控有关［3］。

4 结论

虽然人类对蜂王浆与蜜蜂级型分化关系的认识已有100多年历史，但是对蜂王浆中发挥作用的成分及机理一直没有定论。关于蜂王浆的作用机理，之前已有学者从营养基础、分化关键时期、内分泌调节、基因调控等多方面概述了蜜蜂级型分化的相关研究结果［1］。相关研究报道表明，蜜蜂级型分化是一个复杂的生长发育调节过程，许多重要生理因子参与其中，包括JH、蜕皮激素、胰岛素/胰岛素类似物信号通路等。JH决定级型发育轨迹，并能阻止卵巢发育过程中细胞的程序性死亡;蜕皮激素可协同JH的调节作用。蜂王与工蜂的个体大小及相关器官大小的级型特异性差异与胰岛素/胰岛素类似物信号通路密切相关［2］。Barchuk等根据已有研究提出了蜜蜂的级型分化模型:蜂王较高的JH滴度促进了躯体生长和卵巢发育而抑制了细胞凋亡及脑、后足特化构造的发育;与之相反，较低的JH滴度使工蜂脑神经发生增加及后足特化，从而抑制了躯体生长、卵巢发育及细胞凋亡增加。经过一系列复杂的生理生化过程，最终产生了级型分化现象［2］。关于蜂王浆中决定级型分化的关键成分，有报道认为是其中的糖分，可能王浆中的糖分起到刺激取食的作用，加快了幼虫取食及发育，但其作用机理如何，蜂王浆中其它成分对级型分化有何影响并不清楚［29-30］。镰仓昌树的研究为人类认识蜜蜂级型分化过程提供了重要的理论依据。

与此同时，镰仓昌树的新发现也为人类认识蜂王浆的营养保健功能、功效成分、作用机理的提供了全新思路。蜂王浆是公认的功能食品和营养补充剂，长期以来，国内外蜂王浆贸易中将王浆酸含量高低作为衡量蜂王浆质量及辨别真伪的最主要的指标［31-32］。日本蜂王浆公正取引协会最早把王浆酸列为蜂王浆的质量指标，后来把进口蜂王浆的王浆酸含量从最初的1.4%提高到2.0%～2.2%才算合格，导致我国一些生产企业从内销蜂王浆中提取王浆酸添加到出口产品［33］，使部分内销蜂王浆成为“空心浆”。我国现行蜂王浆标准把王浆酸、粗蛋白、总糖含量列为质量指标［34］。由于已发现MRJP1对人体和哺乳动物细胞具有促进分裂、增殖、DNA合成等功能，预期今后MRJP1等蜂王浆主蛋白对哺乳动物和人类的功能和作用机理将成为研究热点。我国是目前世界上蜂群数量最多的国家，每年产蜂王浆约2000t，产量和出口量占全球的60%～90%，主要出口国家和地区包括欧洲、美国和日本［7，32］，开展蜂王浆主蛋白的研究和功能食品的深度开发，将具有重要的经济和战略意义。

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The key factor induces differentiation of queen and worker in honeybees-main royal jelly protein 1

LIU Dan-dan1，XIAO Fa1，YANG Xiao-li1，LI Mei-lu1，ZENG Yan-jun1，YU Zhang-ying1，SHEN Li-rong1，*，QIU Wei2，YIN Zhi-hong2
(1.College of Bio-systems and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China;2.Hangzhou Biyutian Health-care Production Co.，Ltd.，Hangzhou 311500，China)

TS201.1

A

1002-0306(2012)12-0371-05

2011-09-13 *通讯联系人

柳丹丹(1988-)，女，硕士研究生，研究方向:食品营养与分子生物学。

国家863计划项目(2007AA10Z324);浙江省公益技术应用研究计划项目(2011C22029);杭州市科技发展计划项目(20110232B52)。