异丙酚对急性肺栓塞大鼠炎性因子表达的影响

马小刚 霍华治 苏春永 王 超(邯郸市中心医院，河北 邯郸 05600)

异丙酚对急性肺栓塞大鼠炎性因子表达的影响

马小刚 霍华治 苏春永 王 超1(邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

目的 观察异丙酚对急性肺栓塞(PTE)大鼠炎性因子的影响。方法 大鼠分为假手术组、模型组、异丙酚低、中、高剂量(4，8，16 mg/kg)组。制备急性自体血栓PTE模型。进行血气分析;检测肺系数、湿/干重(W/D);放射免疫法检测血液中内皮素(ET)-1、血栓素B2(TXB2)含量;RT-PCR检测肺组织白介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α mRNA的表达;Western印迹方法检测IL-1、IL-6、TNF-α蛋白的表达。结果 异丙酚能显著升高PO2、PCO2水平，降低肺系数、湿/干重、ET-1、TXB2含量，降低IL-1、IL-6、TNF-αmRNA和蛋白表达(P＜0.05)。结论 异丙酚能抑制炎性因子的表达，对PTE大鼠起保护作用。

异丙酚;肺栓塞;炎性因子

肺血栓栓塞症(PTE)以肺循环和呼吸功能障碍为主要的临床和病理生理特征。研究PTE中炎症因子的表达及相互关系，对更好地了解PTE发生机制及药物干预是非常重要的。异丙酚是一种较新型的静脉麻醉药物，在发挥麻醉效应的同时，因其静脉输入，可对全身组织产生不同的影响〔1〕。我们前期研究结果显示异丙酚对PTE大鼠有保护作用〔2〕，在此基础上，我们观察大鼠PTE后炎症因子白介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的情况，并进一步探讨异丙酚对PTE大鼠炎症因子的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SD大鼠，清洁级，雄性，280～300 g，由河北省实验动物中心提供。

1.2 药物与试剂 异丙酚由四川蜀乐药业股份有限公司提供;内皮素-1(ET-1)和血栓素-2(TXA2)试剂盒购自中国人民解放军总医院科技丌发中心放免研究所;IL-1、IL-6、TNF-α引物由上海生工生物技术公司合成，一抗购自Santa Cruz公司。

1.3 大鼠PTE模型建立 大鼠尾静脉取血0.2 ml，收集入无菌试管内，37℃水浴箱内过夜，第2天分割成5 mm×1 mm的栓子，放入2 ml的注射器内备用。大鼠用20%名乌拉坦麻醉，颈化中切开，分离右侧颈总静脉，采用导管方法将混有15个血栓的2 ml生理盐水注入静脉。注入血栓后可见大鼠明显发绀，呼吸加快。

1.4 动物分组与给药 SD大鼠，40只，随机分为假手术组(Ⅰ)、模型组(Ⅱ)、异丙酚低剂量(Ⅲ):4 mg·kg－1·h－1、异丙酚中剂量(Ⅳ):8 mg·kg－1·h－1、异丙酚高剂量组(Ⅴ):16 mg·kg－1·h－1。每组8只动物。Ⅱ ～Ⅴ组注入栓子后，Ⅲ～V组分别继续输注异丙酚(用5%葡萄糖稀释)4 h，Ⅱ组继续输注5%葡萄糖2 ml/h。Ⅰ组颈静脉输注生理盐水。输注异丙酚4 h时，腹主动脉取血处死动物。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 血气分析 各组实验动物于栓塞前、栓塞后、输注异丙酚后，分离颈总动脉，取血作血气分析。

1.5.2 肺系数及湿/干重(W/D)测定 仔细切除肺外支气管和脂肪组织，称肺重，计算肺系数=肺重/体重。取右侧肺称重，置烘箱烘成恒重后，再次称重，进行W/D计算。

1.5.3 ET-1和TXB2含量测定 取全血，按试剂盒的要求及步骤采用放射免疫法测定。

1.5.4 RT-PCR方法检测大鼠肺组织IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表达 取肺组织，常规方法提取总RNA，按RT-PCR试剂盒说明进行反转录及PCR反应，引物序列:IL-1上游引物:5'-TGTGACTCGTGGGATGATGAC-3'， 下 游 引 物:5'-CCCGACCATTGCTGTTTCCT-3'，长度 460 bp。IL-6上游引物:5'-GTTGCCTTCTTGGGACTGATG-3'，下游引物:5'-CCTTAGCCACTCCTTCTGTGAC-3'，长 度 525 bp。TNF-α 上 游 引 物:5'-CCACCACGCTCTTCTGTCTA-3'，下游引物:5'-GGCAGCCTTGTCCCTTGAA-3'，长度315 bp。内参照β-actin上游引物:5'-CAGGGTGTGATGGTGGG-3'，下游引物:5‘-GGAAGAGGATGCGGCAG-3'，长度500 bp。

PCR 反应条件为 95℃4 min，预变性后，95℃ 30 s，56℃40 s，72℃ 30 s，25 个循环后，72℃ 延伸10 min。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，扫描成像，用凝胶成像分析系统进行密度分析。以β-actin作为内参照。以各目的基因片段密度值/内参照密度值的比值进行比较。

1.5.5 Western印迹法检测大鼠肺组织IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表达 取肺组织，常规方法提取蛋白质，定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，用一抗4℃孵育过夜，PBS漂洗三次后加二抗 HRP(辣根过氧化酶)-IgG(1∶1 000)，室温孵育2 h，化学发光法显色，对条带进行吸光度积分扫描。β-actin作为内参照。用各蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。

2 结果

2.1 血气分析 栓塞后，Ⅱ～Ⅴ组血氧分压(PO2)和血二氧化碳分压(PCO2)明显下降，与Ⅰ组比较差异有显著性(P＜0.05)。与Ⅱ组比较，Ⅲ～Ⅴ组治疗后PO2和PCO2均显著升高(P＜0.05)。见表1。

表1 异丙酚对急性肺栓塞大鼠PO2和PCO2的影响(mmHg，±s，n=8)

与Ⅱ组比较:1)P＜0.05;与Ⅰ组比较:2)P＜0.05;下表同

组别 PO2栓塞前 栓塞/假手术后 治疗后PCO2栓塞前 栓塞/假手术后 治疗后Ⅰ组 96.34±8.38 95.08±9.041)96.16±9.151)40.76±4.65 42.09±5.121)41.15±5.451)Ⅱ组 95.87±9.25 63.38±8.282)65.29±8.282)41.08±4.38 31.28±4.962)32.63±4.442)Ⅲ组 96.33±8.91 64.89±7.762)76.38±8.731)2)42.33±5.21 30.76±4.072)38.13±4.421)Ⅳ组 95.91±8.03 66.06±8.942)77.03±9.431)2)41.59±4.55 32.71±4.612)38.29±4.231)Ⅴ组 97.24±9.08 65.98±8.532)83.53±9.681)2)40.87±5.09 31.14±4.732)39.17±4.751)

2.2 大鼠肺系数、W/D、ET-1、TXB2含量的变化 与Ⅰ组比较，Ⅱ组大鼠肿系数、W/D、ET-1、TXB2含量均明显升高(P＜0.05)，与Ⅱ组比较，Ⅲ ～V 组肺系数、W/D、ET-1、TXB2含量均显著降低(P＜0.05)。见表2。

表2 异丙酚对急性肺栓塞大鼠肺系数、W/D、ET-1、TXB2含量的影响(±s，n=8)

表2 异丙酚对急性肺栓塞大鼠肺系数、W/D、ET-1、TXB2含量的影响(±s，n=8)

组别 肺系数 W/D ET-1(pg/L) TXB2(pg/L)Ⅰ组 0.45±0.041)4.21±0.811)43.46±5.831)252.11±30.811)Ⅱ组 0.54±0.042)7.14±1.572)60.59±9.652)334.92±33.832)Ⅲ组 0.48±0.051)5.63±1.231)2)48.97±8.401)296.73±21.791)2)Ⅳ组 0.48±0.051)5.36±1.251)2)47.15±8.551)285.10±20.081)2)Ⅴ组 0.46±0.061)5.25±1.241)2)46.15±6.701)282.17±27.151)2)

2.3 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表达的变化 RT-PCR结果显示与Ⅰ组比较，Ⅱ组IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表达显著升高(P＜0.05)，与Ⅱ组比较，Ⅲ ～V 组 IL-1、IL-6、TNF-α mRNA 表达显著下降(P＜0.05)。见表3。

表3 异丙酚对大鼠肺组织IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表达的影响(±s，n=8)

表3 异丙酚对大鼠肺组织IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表达的影响(±s，n=8)

组别 IL-1 IL-6 TNF-αⅠ组 0.16±0.021)0.17±0.031)0.15±0.031)Ⅱ组 1.48±0.102)1.35±0.082)1.36±0.102)Ⅲ组 0.86±0.051)2)0.83±0.061)2)0.92±0.071)2)Ⅳ组 0.70±0.051)2)0.64±0.051)2)0.67±0.051)2)Ⅴ组 0.40±0.041)2)0.43±0.041)2)0.41±0.051)2)

2.4 IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表达的变化 结果与Ⅰ组比较，Ⅱ组IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表达显著升高(P＜0.05)，与Ⅱ组比较，Ⅲ ～V 组 IL-1、IL-6、TNF-α 蛋白表达显著下降(P＜0.05)，与RT-PCR结果一致。见表4。

表4 异丙酚对大鼠肺组织IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表达的影响(±s，n=8)

表4 异丙酚对大鼠肺组织IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表达的影响(±s，n=8)

组别 IL-1 IL-6 TNF-αⅠ组 0.17±0.051)0.15±0.031)0.17±0.021)Ⅱ组 1.42±0.162)0.80±0.102)1.02±0.142)Ⅲ组 0.89±0.111)2)0.63±0.091)2)0.68±0.081)2)Ⅳ组 0.55±0.071)2)0.45±0.061)2)0.50±0.071)2)Ⅴ组 0.41±0.051)2)0.25±0.031)2)0.27±0.041)2)

3 讨论

寻找有效的治疗药物一直是肺栓塞研究的热点，且其具体发病机制仍需进一步探讨。异丙酚是一种静脉麻醉药物，已有研究表明异丙酚对急性肺损伤、PTE均有保护作用，但异丙酚在急性自体血栓肺栓塞中的作用研究尚不多见。本实验提示异丙酚对PTE大鼠有保护作用。

近年来炎症反应与血栓形成的关系逐渐引起有关学者的重视〔3〕，研究认为肺血栓栓塞后启动复杂的炎症反应介导凝聚级联反应，受损的血管细胞和激活的局部炎症细胞(白细胞、单核/巨噬细胞等)可释放一系列的细胞因子如TNF-α、白介素(IL-1、IL-6等)及其他炎症因子〔4〕。此外，在血凝级联反应中发挥关键作用的凝血酶亦可激活内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞等表达黏附分子，释放炎性介质。通过上述途径释放的细胞因子尤其是TNF-α、IL-1、IL-6和其他的炎性介质引起肺泡毛细血管渗透性升高，造成间质液体聚集和肺水肿，导致肺实质气体交换减少，最终致低氧血症。本实验结果提示PTE后促炎性细胞因子被大量产生，参与了PTE后的病变过程。给予异丙酚处理后能显著抑制肺组织中IL-1、IL-6、TNF-α表达，使炎症反应减弱，改善低氧血症。

另一方面，TNF-α等炎性因子亦可以影响血管舒缩活性物质的表达，Zemel等〔5〕报道了 TNF-α 能引起 TXB2、ET 等缩血管物质的物质的产生增加，引发血管收缩和舒张功能障碍。肺栓塞后动/静脉血浆ET放免活性比值升高，代谢异常，ET-1的增高又可引起肺血管、支气管痉挛和毛细血管通透性增加〔6〕，而在肺栓塞早期，TXA2可介导多形核白细胞与肺毛细血管及动脉内皮细胞的黏附，促进炎症形成，使大量炎性因子表达增加。本研究结果显示异丙酚能明显降低栓塞大鼠的肺系数、W/D、ET-1、TXB2含量，抑制炎性因子的表达，降低了PTE病变程度。

1 Vasileiou I，Xanthos T，Koudouna E，et al.Propofol:a review of its nonanaesthetic effects〔J〕.Eur J Pharmacol，2009;605(1-3):1-8.

2 霍华治，苏春勇，马小刚.异丙酚对大鼠急性自体血栓肺栓塞的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(9):1257-9.

3 Bu DX.Griffin G，Lichtman AH.Mechanisms for the anti-inflammatory effects of statins〔J〕.Curr Opin Lipid，2011;22-(3):165-70.

4 Li J，Li J，Zhang L，et al.Penehyclidine prevents nuclear factor-kappaB activation in acute lung injury induced by lipopolysaccharide〔J〕.J Pharm Pharmacol，2008;60(9):1197-205.

5 Zemel D，Koomen GC，Hart AA，et al.Relationship of TNF-alpha，interleukin-6，and prostaglandins to peritoneal permeability for macromolecules during longitudinal follow-up of peritonitis in continuous ambulatory peritoneal dialysis〔J〕.J Lab Clin Med，1993;122(6):686-96.

6 Sofia M，Stanislaao F，Marco A.et al.Endothelin abnormalities in patients with pulmonary embolism〔J〕.Chest，1997;111(3):544-9.

〔2011-03-30收稿 2011-03-27修回〕

(编辑 曹梦园)

Effects of propofol on expression of inflammatory factor in acute autoblood pulmonary thromboembolism of rats

MA Xiao-Gang，HUO Hua-Zhi，SU Chun-Yong，et al.
Handan Center Hospital，Handan 056001，Hebei，China

Objective To investigate the effects of propofol on inflammatory factors expressions in acute pulmonary thromboembolism(PTE)of rats.Methods Rats were randomly divided into sham，model and propofol groups(4，8，16 mg/kg).Rat PTE model was established by intravenous injection of auto-blood clots.The PO2and PCO2in arterial blood were measured.The coefficient and wet/dry weight(W/D)of lung were detected.The concentrations of ET-1 and TXB2 in plasma were examined by radio-immunity technique.The mRNA expressions of IL-1，IL-6 and TNF-α in lung tissue were assessed by RT-PCR.The protein expressions of IL-1，IL-6 and TNF-α in lung tissue were assessed by Western blot.Results The PO2，PCO2in arterial blood were significantly increased，while the coefficient，W/D of lung，the contents of ET-1 and TXB2，the expressions of IL-1，IL-6 and TNF-α were significantly decreased after administration with propofol.Conclusions Propofol could inhibit the expressions of inflammation factors and protect PTE rats.

Propofol;Pulmonary thromboembolism;Inflammatory factor

R563.5

A

1005-9202(2012)17-3696-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.039

河北省自然科学基金资助项目(C2011307008)

1 河北省人民医院

王 超(1975-)，男，博士，主要从事老年病学研究。

马小刚(1975-)，男，主治医师，主要从事胸外科疾病研究。