金雀异黄素诱导人白血病Jurkat E6-1细胞凋亡的机制

何 坚袁 颖李万里 (新乡医学院免疫学教研室，河南 新乡 453003)

金雀异黄素诱导人白血病Jurkat E6-1细胞凋亡的机制

何 坚1袁 颖2李万里 (新乡医学院免疫学教研室，河南 新乡 453003)

目的 探讨金雀异黄素(Gen)对Jurkat E6-1人白血病细胞的凋亡诱导作用。方法 用激光共聚焦技术观察金雀异黄素对Jurkat E6-1白血病细胞形态的影响;流式细胞术检测细胞凋亡;Western印迹方法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3的表达。结果 Gen各浓度组瘤细胞皱缩、变形，染色质浓缩，部分核染色体碎裂，呈高蓝低红色;与1640组相比，Gen各浓度组凋亡率均呈显著增高，且随着Gen浓度的升高，凋亡率也增高;Gen 0.1、1.0、10.0 μmol/L组的Bax和Caspase-3蛋白条带强度递增，并明显高于1640组，而Bcl-2蛋白条带强度则递减，并明显低于1640组。结论 Gen对Jurkat E6-1白血病细胞可能通过上调Bax和Caspase-3蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达来诱导其凋亡。

金雀异黄素;Jurkat E6-1细胞;Bax;Caspase-3;Bcl-2

老年白血病一般多指年逾60岁所患病因不明的原发造血干细胞的恶性疾病，60岁～69岁的患者占到老年白血病患者的78.6%。白血病的治疗以化疗、放疗治疗为主，但是有相当的副作用，因此研究无明显副作用的尤其是对于老年白血病患者的辅助治疗方法具有重要意义。金雀异黄素(Gen)是大豆异黄酮的主要成分，是一种天然的植物雌激素，具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗氧化，防止骨质疏松等等。研究表明，金雀异黄素可抑制胃癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌细胞等的增殖。但是在白血病方面的研究国内外报道少见〔1，2〕。本文研究Gen对Jurkat E6-1白血病细胞的凋亡诱导作用。

1 材料与方法

1.1 药物与主要试剂 Gen购自Sigma公司，RPMI 1640完全培养基、10%的胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司。青、链霉素双抗液购自南京凯基生物科技有限公司。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂、兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗、Ecl发光液、细胞裂解液、蛋白酶抑制剂购于碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 共聚焦显微镜观察 常规培养Jurkat细胞。细胞经不同剂量(0.1、1.0、10.0 μmol/L)Gen 处理 48 h 后，离心，PBS 清洗2次，细胞沉淀用1 ml细胞染色缓冲液重悬。分别加入5 μl Hoechst染色液和PI染色液，混匀，冰浴30 min。检测前离心沉淀细胞，用PBS洗涤一次，涂片在共聚焦显微镜下观察。

1.2.2 流式细胞仪分析 常规培养Jurkat细胞，各组细胞重复4 次经不同剂量(0.1、1.0、10.0 μmol/L)Gen 处理 48 h 后，PBS清洗2次，取5万重悬的细胞，2 000 r/min，离心5 min，弃上清，加入195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温避光孵育 10 min。2 000 r/min，离心 5 min，弃上清，加入 190 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10 μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，随即进行流式细胞仪检测。

1.2.3 Western印迹检测Bax、Bcl-2和Casepase-3的表达 常规培养Jurkat细胞。各组细胞重复4次经不同剂量(0.1、1.0、10.0 μmol/L)Gen处理48 h后，收集细胞。提取蛋白样品经过SDS-PAGE后转移到PVDF膜，用含有5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，用封闭液稀释的鼠抗人Caspase-3或Bax、Bcl-2抗体4度封闭膜过夜，洗涤后将膜于封闭液稀释的HRP-抗鼠抗体溶液中室温放置2 h，经TBST洗膜后在ECL反应液中反应1 min，暗室显影。用β-actin做内对照检测上样量一致性。

2 结果

2.1 激光共聚焦观察 1640组细胞核大小较均一，呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀，紫外光下呈蓝色荧光;而Gen各浓度组瘤细胞则皱缩、变形，染色质浓缩，部分核染色体碎裂，呈高蓝低红色(见图1)。

图1 激光共聚焦检测

2.2 流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染色法检测结果 与1640组相比，Gen各浓度组凋亡率均呈显著增高，且随着Gen浓度的升高，凋亡率也增高(表1)。

2.3 Gen诱导 Jurkat E-6细胞株凋亡中 Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响 0.1、1.0、10.0 μmol/L Gen组的 Bax和Caspase-3蛋白条带强度递增，并明显高于对照组1640组。而Bcl-2蛋白条带强度则递减，并明显高于对照组1640组。表明Gen可上调Bax和Caspase-3蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达(图2，表2)。

表1 GEN对Jurkat E-6细胞凋亡率的影响(±s，n=4)

表1 GEN对Jurkat E-6细胞凋亡率的影响(±s，n=4)

与1640组比较:1)P＜0.01;与GEN0.1 μmol/L组比较:2)P＜0.01

组别 早期凋亡率 晚期凋亡率1640组2.407±0.307 4.315±0.580 GEN0.1 μmol/L组 4.730±0.6391)9.123±0.7391)GEN1.0 μmol/L组 10.615±0.8421)2)15.890±2.6291)2)GEN10.0 μmol/L 组 16.079 ±2.6601)2)36.559 ±4.8721)2)

表2 GEN对Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响(±s，n=4)

表2 GEN对Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响(±s，n=4)

与1640组比较:1)P＜0.01;与GEN0.1 μmol/L组比较:2)P＜0.01

组别Bax Bcl-2 Caspase-3 1640组0.3±0.034 0.711±0.117 0.349±0.032 GEN0.1 μmol/L组 0.4±0.0561) 0.620±0.068 0.347±0.057 GEN1.0 μmol/L组 0.6±0.0701)2)0.526±0.0441)2) 0.609±0.0691)2)GEN10.0 μmol/L组 0.9±0.1641)2)0.298±0.0491)2) 0.821±0.1311)2)

图2 凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达

3 讨论

白血病患者的免疫功能低下，化疗继发感染是老年人白血病严重的并发症和主要死亡原因之一〔3〕。本研究说明不同浓度Gen组细胞发生凋亡现象并且和Gen浓度相关。Gen可通过上调Bax和Caspase-3蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达来诱导人白血病Jurkat E6-1细胞凋亡，王光辉等〔4〕研究表明凋亡机制是通过上调Bax和下调Bcl-2来实现的，与本研究结果一致，是金雀异黄素诱导白血病Jurkat E6-1细胞凋亡的机制之一。

1 Messina M，Hilakivi-Clarke L.Early intake appears to be the key to the proposed protective effects of soy intake against breast cancer〔J〕.Nutr Cancer，2009;61(6):792-8.

2 范玉贞，李国辉，王玉华，等.金雀异黄素的体内与体外抗结肠癌作用及其机制〔J〕.中华肿瘤杂志，2010;32(1):4-9.

3 许惠丽.老年急性髓细胞白血病感染的调查分析〔J〕.Modern Pre Med，2010;37(23):4552-3.

4 王光辉，陈海峰，王乃利，等.Protobioside抑制肿瘤细胞增殖作用的机制研究〔J〕.中国中药杂志，2009;34(24):3286-8.

〔2011-05-05收稿 2011-09-12修回〕

(编辑 曹梦园)

R285

A

1005-9202(2012)17-3698-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.040

河南省新乡医学院高学历人才科研启动资助项目(100179)1 广西医科大学免疫学教研室 2 新乡医学院中西医科

李万里(1955-)，男，教授，博士，主要从事肿瘤免疫学研究。第一作者:何 坚(1979-)，女，硕士，主要从事肿瘤免疫学研究。