依达拉奉对大鼠胶原诱导关节炎的治疗作用及其机制

齐 晅 靳洪涛张风肖 (河北省人民医院风湿免疫科，河北 石家庄 050000)

依达拉奉对大鼠胶原诱导关节炎的治疗作用及其机制

齐 晅 靳洪涛1张风肖 (河北省人民医院风湿免疫科，河北 石家庄 050000)

目的 观察依达拉奉(MCI-186)对大鼠胶原诱导关节炎(CIA)的治疗作用及其可能机制。方法 选用24只成年雄性Wistar大鼠，随机分成4组，每组6只，分别为正常组，模型组，依达拉奉低、高剂量组。测定不同时间点各组大鼠的踝关节足垫厚度，生化方法检测了各组大鼠血浆总超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、对大鼠滑膜组织进行组织核因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF)-α的SP免疫组织化学染色，采用真彩色病理图像分析系统进行定量分析。取大鼠双膝关节滑膜组织，光镜下观察关节滑膜衬里层细胞(LCC)增生，衬里下层炎细胞浸润及血管翳形成等病理变化。结果 与正常组相比，模型组血浆总SOD活力下降，MDA含量升高，滑膜组织NF-κB、TNF-α表达增加。依达拉奉高低剂量组均能提高血浆总SOD活力，降低MDA含量，使滑膜NF-κB、TNF-α表达下降，但两组比较无差异。组织形态学光镜下表明依达拉奉组滑膜衬里层增生减少，少见血管翳的形成。结论 依达拉奉对CIA大鼠有明显的抗氧自由基及抗炎作用，能够降低CIA大鼠足垫肿胀程度，抗氧化及抑制炎性因子可能是其主要作用机制。

依达拉奉;胶原诱导关节炎;自由基;炎性细胞

类风湿关节炎 (RA)是一种以多关节受累为主要表现的全身性自身免疫性疾病，其病因及发病机制十分复杂，尚未完全阐明。自由基在RA的发生及发展过程中的地位逐渐受到重视。依达拉奉是一种新型的自由基清除剂，目前主要应用于脑缺血的治疗，其通过清除自由基治疗RA的研究报道很少。本实验以自由基与RA的关系为出发点，应用自由基清除剂依达拉奉治疗胶原诱导关节炎 (CIA)大鼠，探讨依达拉奉对关节炎治疗的效果，并为其抗炎机制寻找可能的实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠30只，8～12周龄，体重140～160 g，河北省实验动物中心提供，合格证号805154，许可证号SCXK(冀)2003-1-003。自由饮水，摄食标准颗粒饲料。

1.2 实验试剂与仪器 依达拉奉购于吉林博大制药有限公司(30 mg/支)，注射用氯诺昔康购于浙江震元制药有限公司(8 mg/支)，鸡Ⅱ型胶原 (0.5 mg/支)及完全弗氏佐剂(CFA，10ml)购于Sigma公司，大鼠丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)的测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所，大鼠NF-κB(p65)、肿瘤坏死因子 (TNF)-α免疫组化试剂盒抗体购自Santa公司，卡介苗 (BCG，50 mg/支)购于北京生物制品研究所、EDTA脱钙剂购自华瑞创新生物科技开发中心。721-B分光光度计 (上海分析仪器三厂)。

1.3 分组 大鼠随机分选取6只，作为正常对照组，余24只建立CIA大鼠模型，造模成功率为75%，把模型鼠随机分为模型组，依达拉奉低剂量组 (3.0 mg/kg，2次/d)，依达拉奉高剂量组 (6.0 mg/kg，2次/d)。

1.4 CIA模型的建立及给药〔1〕将鸡CCⅡ以5 g/L的浓度溶于0.01 mol/L的醋酸溶液，然后和等体积完全弗氏佐剂在4℃水浴用超声乳化仪混匀。其中卡介苗的浓度为2 g/L。于实验第1天第造模组大鼠的尾根部皮内注射上述乳剂0.1 ml，正常对照组大鼠于尾根部皮内注射0.1 ml生理盐水。于实验第2周用同样剂量免疫原在相同部位再次免疫造模组大鼠，第2次免疫后约1 w左右出现多发性关节炎。于致炎后第18天:依达拉奉低高剂量组分别给予依达拉奉3.0、6.0 mg/kg，2次/d腹腔注射;正常对照组大鼠给予生理盐水0.5 ml/d腹腔注射，给药时间均固定在每天8时及20时。

1.5 CIA大鼠标本的采集及处理 于实验的第28天全部大鼠摘取眼球取血，并取膝关节滑膜组织，全部置于4%多聚甲醛固定，行HE染色和免疫组织化学染色。

1.6 检测指标

1.6.1 关节肿胀度的评定 于实验的第0，3，6，9，12，15，18，21，24，27天用游标卡尺测量右后足掌厚度，分别测量3次，取平均值。

1.6.2 血浆SOD及MDA检测 血浆总SOD活力及MDA含量的测定，按照试剂盒说明书操作。

1.6.3 滑膜组织及NF-κB、TNF-α的表达 取滑膜组织标本切片常规脱蜡，3%H2O2室内温育10～15 min，消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗3次。修复抗原，用BSA封闭，室温10～15 min，倾去血清。滴加一抗，4℃过夜。PBS冲洗，5 min，3遍。滴加SP复合物37℃，30～40 min。再用PBS 冲洗，3 遍。PBS 4 ml、DAB 5 g、H2O25 μl，显色 5 min左右 (以镜下适度为好)。蒸馏水洗5次。苏木精复染1 min，水洗，1%盐酸酒精分化、脱水、透明、封固。镜下观察结果，胞质黄色或棕黄色为阳性细胞。并测量出阳性染色部位的积分光密度 (IOD)，代表该切片 NF-κB、TNF-α的表达情况。

2 结果

2.1 依达拉奉对足垫厚度的影响 第0～12天关节肿胀无明显变化，第15天大鼠足部及踝关节出现肿胀，第18～28天关节红肿及软组织肿胀更加明显。见表1。

2.2 依达拉奉对大鼠抗氧化能力的影响 见表2。模型组大鼠SOD较正常组降低，MDA升高(P＜0.01)，依达拉奉治疗后，SOD、MDA 均有改善(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 依达拉奉对大鼠右足垫厚度的影响(±s，mm，n=6)

表1 依达拉奉对大鼠右足垫厚度的影响(±s，mm，n=6)

与正常组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与模型组比较:3)P＜0.05;4)P＜0.01;下表同

组别0 d 12 d 15 d 18 d 21 d 24 d 27 d正常组 4.92±0.08 5.07±0.08 5.13±0.10 5.16±0.08 5.20±0.11 5.25±0.10 5.28±0.08模型组 4.90±0.11 5.37±0.33 6.32±0.811)7.62±0.911)8.13±0.472)7.32±0.432)6.83±0.621)低剂量组 4.98±0.08 5.22±0.29 6.48±1.091)7.92±0.542)7.23±0.782)3)6.47±0.731)3)5.93±0.591)3)高剂量组 4.95±0.10 5.52±0.97 6.33±0.811)7.85±0.342)7.12±0.732)3)6.23±0.681)4)6.77±0.461)4)

表2 依达拉奉对大鼠抗氧化能力的影响(±s，n=6)

表2 依达拉奉对大鼠抗氧化能力的影响(±s，n=6)

组别 SOD(U/ml) MDA(μmol/ml)正常组432.58±25.35 7.13±0.72模型组 282.13±21.012)15.27±1.312)低剂量组 335.02±43.282)3)11.15±0.922)4)高剂量组 377.35±41.552)4)10.35±0.792)4)

2.3 依达拉奉对大鼠滑膜组织NF-κB、TNF-α表达的影响在CIA大鼠关节滑膜中可见NF-κB(p65)、TNF-α阳性染色分布于滑膜衬里细胞、巨噬细胞、成纤维细胞及淋巴细胞中。胞质及胞核内均有染色，但胞核染色较深，多呈团块状分布，而胞质染色较浅。在正常组大鼠滑膜中，衬里细胞、滑膜下层的巨噬细胞及成纤维细胞有少量阳性染色，但染色程度明显弱于模型组及依达拉奉组。见图1及表3。

2.4 大鼠膝关节滑膜的组织学观察 正常组:大鼠滑膜及关节面未见病变，膝关节滑膜衬里层由1～2层滑膜细胞组成且部分不连续。滑膜衬里下层则为由脂肪细胞、少量成纤维细胞、巨噬细胞与少量血管组成的结缔组织，滑膜组织无炎性细胞浸润及胶原纤维。模型组大鼠第28天滑膜组织肿胀，滑膜上皮层增厚，滑膜细胞增大，数量增多，膝关节滑膜衬里层增生可达7～8层，滑膜衬里下层可见少量炎性细胞、浸润，并有少量的成纤维细胞及小血管生成。依达拉奉低高剂量组:上述病变均程度不同地较模型对照组为轻，主要表现为滑膜衬里层增生减少，少见血管翳的形成。见图2。

表3 依达拉奉对大鼠滑膜组织NF-κB、TNF-α表达的影响(±s，μm2，n=6)

表3 依达拉奉对大鼠滑膜组织NF-κB、TNF-α表达的影响(±s，μm2，n=6)

组别 NF-κB TNF-α正常组181.18±37.84 174.87±7.30模型组 563.94±30.362)633.02±41.792)低剂量组 434.25±80.662)4)516.56±36.032)4)高剂量组 289.23±58.402)4)489.30±34.402)4)

图1 各组大鼠滑膜组织NF-κB、TNF-α表达(IH，×400)

图2 各组滑膜细胞(HE，×200)

3 讨论

自由基在RA的发生发展中扮演着重要的作用〔3〕。NF-κB是能与多种基因启动子或增强子上的κB位点发生特异性结合，并能促使基因转录的蛋白质总称。活化的NF-κB能与DNA特定的κB位点结合，启动和调节众多参与炎症反应、免疫反应有关基因的转录，调控 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子的表达〔2〕，这些细胞因子进一步引起关节炎动物模型的关节滑膜增生，血管翳形成，关节软骨变性坏死等等。近年来研究表明自由基充当着NF-κB活性调节的第二信号，其通过对NF-κB活性的调节从而参与了多种途径的细胞信号转导，控制着多种细胞因子的表达生成〔3〕。依达拉奉是目前唯一在临床上使用的自由基清除剂，目前多用于脑缺血的治疗，因此可以通过依达拉奉对自由基的清除作用及对机体抗氧化能力提高的作用缓解RA的症状和病情的发展。

本试验提示CIA大鼠自由基数量的增加及机体抗氧化能力的下降，并且炎性细胞因子也在增加。病理组织观察滑膜衬里层增生，血管翳形成并有炎细胞浸润。而依达拉奉能有效清除自由基数量，提高机体抗氧化能力减少滑膜组织 NF-κB、TNF-α的表达，组织病理学也有明显改善。

本实验表明依达拉奉对CIA大鼠有明显的清除自由基及抗炎作用，延缓CIA大鼠病程进展。这进一步提示依达拉奉治疗CIA大鼠的作用机制可能是通过对血浆中自由基的清除抑制、从而抑制NF-κB、TNF-α等复杂的炎性介质环路。多途径、多环节作用于机体而抑制炎症刺激，减轻炎症反应，使各种炎性因子的合成减少而发挥治疗作用。由于传统的抗风湿药毒副作用大，而新型的生物制剂价格昂贵，依达拉奉就为临床上治疗类风湿关节炎提供了一种新的思路。

1 韩晓枫，马宝骊，张继英，等.鸡胶原Ⅱ型诱导大鼠类风湿模型的建立〔J〕.上海免疫学杂志，2001;21(6):330-3.

2 姚茹冰.核因子κB与类风湿关节炎相关性的研究进展〔J〕.医学研究生学报，2006;19(3):267.

3 徐 康，林 正.自由基对转录因子NF-κB活性的调节〔J〕.医学研究生学报，2004;17(7):654-6.

〔2011-06-22收稿 2011-09-12修回〕

(编辑 曹梦园)

R684.3

A

1005-9202(2012)17-3730-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.053

1 河北医科大学附属第二医院风湿免疫科

靳洪涛(1963-)，男，主任医师，硕士生导师，主要从事风湿病的诊断治疗。

齐 晅(1982-)，男，医师，主要从事风湿病的诊断治疗。