人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549／GR的建立及小白菊内酯逆转耐药机制研究＊

刘 英，姚开泰，肖广惠

（南方医科大学肿瘤研究所，广州510515）

人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549／GR的建立及小白菊内酯逆转耐药机制研究＊

刘 英，姚开泰，肖广惠△

（南方医科大学肿瘤研究所，广州510515）

目的建立人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549／GR，研究其耐药机制，探讨小白菊内酯（PAR）逆转A549／GR耐药的机制。方法以吉非替尼为诱导剂，人肺腺癌细胞系A549为诱导对象，采用大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法，诱导建立人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549／GR。采用细胞毒实验（MTT）法测定细胞耐药指数，免疫印迹法（Western blotting）检测细胞耐药相关蛋白表达水平，进一步通过MTT法检测PAR对A549／GR的逆转倍数，Annexin V－FITC双标法检测PAR的促凋亡作用，Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白表达水平。结果所建立的人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549／GR耐药指数为18.7。A549／GR细胞中MDR和ABCG2耐药相关蛋白表达水平较A549升高。MTT结果显示PAR对耐药细胞A549／GR的逆转倍数为8.66。Annexin V－FITC凋亡检测结果显示PAR能有效促进A549／GR细胞凋亡，Western blotting检测显示PAR能有效降低survivin、Bcl－2两种抑制凋亡相关蛋白的表达。结论成功建立了人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549／GR；PAR通过促进A549／GR细胞凋亡有效逆转其耐药。

肺肿瘤；抗药性；细胞凋亡；逆转剂；靶向治疗

肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，近年来，肺癌的发病率和病死率均迅速上升。肺癌的治疗方案是以手术为主的综合治疗，随着靶向药物的问世，使肺癌的治疗向前迈进了一大步。靶向药物是目前最先进的用于治疗恶性肿瘤的药物，它通过与癌症发生、发展所必需的特定分子靶点的作用来阻止癌细胞的生长。故靶向药物以其高特异性、低细胞毒性的特点，逐渐成为临床肿瘤治疗的首选药物［1－2］。吉非替尼（gefitinib，商品名Iressa）是一种选择性表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂，2003年被美国食品药品管理局（FDA）批准作为非小细胞肺癌（NSCLC）的三线治疗药物，主要用于治疗既往接受过化学治疗的局部晚期或转移性NSCLC［3－4］。然而在用药过程中出现吉非替尼耐药使得肺癌治疗再次陷入困境，为此寻找高效、低毒的逆转剂逆转肿瘤治疗过程中出现的多药耐药已是一个重要研究方向。

研究发现，许多天然植物成分能诱导肿瘤细胞凋亡，并能使肿瘤细胞发生细胞周期阻滞，抑制其增殖。小白菊内酯（parthenolide，PAR）是从菊科植物野甘菊中提取的一种倍半萜内酯化合物，西方国家曾主要用于治疗皮肤感染、风湿病和偏头疼。近年来，发现PAR具有多种生物活性，并且对多种肿瘤株有抑制作用。本研究通过体外实验检测PAR能否逆转人肺癌吉非替尼耐药细胞A549／GR的耐药性，并探讨其逆转耐药的机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 吉非替尼，阿斯利康公司产品，剂型：250毫克／片；PAR、二甲基四氮唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）均为Sigma公司产品。PRMI1640完全培养液、胎牛血清和胰蛋白酶为 Hyclone公司产品。抗体 MDR、ABCG2、survivin、Bcl－2和内参磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体均为Sanata Cruz公司产品。Annexin V－FITC凋亡试剂盒为Key GEN公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞系、细胞培养及耐药细胞诱导方法 人肺腺癌细胞株A549为南方医科大学肿瘤研究所保存、复苏传代所得。用含10%胎牛血清和青霉素、链霉素各100U／mL的1640培养基，置于37℃5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的细胞进行实验。耐药细胞采用大剂量冲击和逐渐增加剂量相结合的方法诱导产生［5－6］。先用细胞毒实验（MTT）法测定吉非替尼对敏感细胞的半数抑制浓度（IC50）为1.88μmol／L，然后用含18μmol／L吉非替尼的培养基培养24h，立即更换含半数抑制浓度吉非替尼的培养基培养5～10d，直至细胞稳定生长并传代3次，再次测定IC50。然后再次用含18μmol／L吉非替尼的培养基培养冲击24h，更换吉非替尼半数抑制浓度渐次提高了的培养基。直至细胞在含有18μmol／L吉非替尼的培养基中稳定生长并连续传代3次，最后测定吉非替尼的IC50为35.10μmol／L，命名为A549／GR。

1.2.2 MTT法 实验前将A549／GR细胞传代，在不含吉非替尼的培养基中培养至少7d。选取对数生长期的细胞，调整细胞密度为1×105／mL，加入96孔板，每孔100μL。置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养至细胞完全贴壁。次日换液后再分别加入100μL呈半数药物浓度梯度的培养基，每孔总体积为200μL，共设置7个浓度梯度，1个空白对照，各种药物浓度做3个平行孔。培养72h后，每孔加入5mg／mL的MTT 20μL，继续培养4h，吸出培养基，每孔加入DMSO 150 μL，轻微振荡10min溶解结晶。以490nm为检测波长，在酶标仪上检测各孔的吸光度（A）值，细胞存活率＝（实验组A值／对照组A值）×100%，计算IC50值。耐药倍数＝耐药细胞IC50／亲代细胞IC50，逆转倍数＝使用逆转剂前IC50／使用逆转剂后IC50。MTT实验在不同日重复3次。

1.2.3 细胞凋亡检测 将生长状态良好的A549／GR细胞分别设置对照组和PAR处理组两组，加药作用72h后，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化收集细胞团块。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次（2 000r／min离心5min）收集（1～5）×105个细胞；加入500μL的Binding缓冲液悬浮细胞；加入5μL Annexin V－FITC混匀后，加入5μL碘化丙啶（PI），混匀；室温，避光、反应5～15min；在1h内进行流式细胞仪的观察和检测，收集图片并进行数据分析。

1.2.4 蛋白提取和免疫印迹法（Western blotting）检测 用冰预冷的RIPA 细胞裂解液（50mmol／L Trison HCl pH 7.4，150mmol／L NaCl，1%Triton X－100，1%sodium deoxycholate，0.1%SDS，1mmol／L EDTA，1mmol／L PMSF）分别裂解A549、A549／GR（对照组、单药吉非替尼组及PAR联合吉非替尼组）共4组细胞，离心收集上清。BCA法测定蛋白浓度。取20μg蛋白上样，经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）后转膜，室温封闭90min，加入一抗（Mdr，1∶500；ABCG2，1∶500；survivin，1∶500；Bcl－2，1∶500；GAPDH，1∶1 000），4℃过夜；洗膜缓冲液（TBST）洗膜5 min，3次后加入二抗（1∶1 000）室温孵育90min，用TBST洗膜5min，3次，ECL化学发光显色，由Bio RAD凝胶成像仪摄取凝胶图像，用Quantity One软件进行吸光度分析，实验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行描述性统计分析。

2 结 果

2.1 细胞耐药指数检测 通过大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法，历时8个月建立了吉非替尼的耐药细胞系，命名为A549／GR，以细胞存活率为纵坐标、吉非替尼浓度为横坐标作图（图1）。可见在相同吉非替尼浓度下，A549／GR的存活率高于A549，吉非替尼对两细胞的IC50分别为35.10μmol／L（A549／GR）和1.88μmol／L（A549），耐药指数为18.7。

图1 A549／GR细胞的耐药性检测

2.2 耐药相关蛋白的检测 Western blotting检测耐药相关蛋白，结果显示与亲代细胞A549对比，耐药细胞A549／GR中MDR和ABCG2两种耐药相关蛋白都明显升高，见图2。

图2 Western blotting检测A549和A549／GR细胞中MDR和ABCG2蛋白表达水平

2.3 PAR体外逆转耐药实验 联合低剂量PAR（20μmol／L）用药可明显降低吉非替尼对A549／GR半数抑制浓度，以细胞存活率为纵坐标、吉非替尼浓度为横坐标作图（图3）。联合应用PAR前后吉非替尼对A549／GR的IC50分别为35.10μmol／L吉非替尼单药组和4.05μmol／L吉非替尼联合PAR用药组），其逆转倍数为8.66。

图3 PAR逆转A549／GR耐药实验

2.4 PAR逆转耐药机制的探讨 Annexin V－FITC凋亡检测结果显示，低剂量PAR（20μmol／L）作用于A549／GR可以有效诱导细胞凋亡（图4）。同时 Western blotting检测结果显示，与对照组相比，低剂量PAR及联合吉非替尼用药组细胞中，survivin、Bcl－2两种抑制凋亡相关蛋白都明显降低，且联合用药降低更明显，见图5。

图4 A549／GR细胞凋亡分析

图5 Western blotting检测蛋白survivin及Bcl－2的表达水平

3 讨 论

当肿瘤对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制不同的其他抗肿瘤药物也产生交叉耐药性，通常称之为多药耐药性（multi－drug resistance，MDR），早在1970年 Biedler等［7］就首次报道肿瘤存在MDR现象。在对肿瘤MDR现象的研究过程中发现，有些肿瘤经诱导才会产生耐药性，即在首次用药或前几个疗程是敏感的，到后来才逐渐耐药，这种称之为获得性耐药即后天耐药。在临床肿瘤患者中，绝大多数是属于获得性耐药，即一开始是对治疗敏感的，但是用药治疗几个周期后，肿瘤开始对药物耐受并出现复发或者转移现象。采用大剂量冲击和逐步增加药物剂量相结合的方法诱导产生的耐药细胞株，这与临床上肿瘤患者出现耐药的机制类似，更有研究价值。故本课题采用大剂量冲击和逐步增加药物剂量相结合的方法历时8个月，成功诱导建立人非小细胞肺癌吉非替尼耐药细胞系A549／GR，通过MTT实验证实该耐药细胞系的耐药指数高达18.7。

关于MDR的产生已经提出几种较为肯定的机制，其中最为重要的机制被认为是细胞膜上存在一种P－糖蛋白（P－glycoprotein，P－gp）引起，1976年Juliano等［8］在耐药的中国仓鼠卵巢癌细胞中发现一种相对分子质量为1.7×105的糖蛋白，被命名P－gp，它是多药耐药基因 MDR1基因编码的产物［9］。P－gp能将细胞内的化疗药物泵出胞外，从而降低细胞内的有效药物浓度产生耐药，呈现典型的MDR表型。ABCG2是ABC转运体超家族的成员之一。ABC转运体的表达是肿瘤细胞对化疗药物耐受的一个重要机制，现在已经发现3个人类的ABC转运体与多药耐药相关，这3个转运体是P－gp、MRP1（multidrug resistance protein 1）和ABCG2。这3个转运体的转运底物特异性很广，而且在一定程度上重叠，能够转运当前癌症化疗中的主要药物［10］。本研究建立的人肺腺癌吉非替尼耐药细胞A549／GR中MDR、ABCG2耐药相关蛋白，表达较亲代细胞A549明显升高，这可能是A549／GR产生耐药的主要机制。

肺癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，在治疗过程中出现的多药耐药现象使得肺癌对化疗和靶向治疗不敏感，从而导致治疗效果不理想、病死率高。因此，逆转人肺癌多药耐药性是提高肺癌疗效的有力手段。目前，逆转剂主要有Ca2＋通道拮抗剂（如维拉帕米）及其衍生物、免疫调节剂（如环孢菌素A）、抗雌激素类（如三苯氧胺）等，但这些药物因其固有的药理作用而限制了临床应用，因此，研究筛选高效低毒的MDR逆转剂，是提高恶性肿瘤疗效的重要途径。已有研究证明，PAR能促进细胞毒药物顺铂对肝癌细胞HepG2凋亡，二者联合具有协同作用［11］。亦有研究表明PAR通过促进胃癌细胞SGC7901凋亡达到抗肿瘤作用［12］。本研究针对自主诱导产生的人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549／GR，MTT实验结果显示，联合低剂量PAR（20μmol／L）应用后，吉非替尼对A549／GR的IC50较单独应用吉非替尼组IC50明显降低，逆转倍数高达8.66，从而证实PAR能有效逆转人A549／GR耐药作用。而且对比第一、二代逆转剂，PAR具有高效低毒的特点，从而突破前几代逆转剂不良反应太大而限制其临床应用的局限性。AnnexinV－FITC双标凋亡检测显示低剂量PAR可有效诱导A549／GR细胞凋亡，同时Western blotting检测发现PAR可降低凋亡抑制蛋白survivin和Bcl－2表达，结果表明PAR逆转A549／GR可能的耐药机制是通过降低凋亡抑制蛋白表达进而促进耐药细胞凋亡实现的，至于PAR是否存在其他逆转耐药有关的机制还有待进一步研究。

本研究成功建立稳定的人肺腺癌吉非替尼耐药细胞系A549／GR，并寻找到一种高效、低毒的逆转剂PAR逆转细胞耐药，为解决肺癌患者MDR问题提供了一个可能的新途径。

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Establishment of the gefitinib－resistant A549／GR cell line of humam lung adenocarcinoma and investigation of the mechanism of parthenolide in reversing drug resistance＊

Liu Ying，Yao Kaitai，Xiao Guanghui△
（Cancer Research Institute，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong510515，China）

ObjectiveTo establish a gefitinib resistant cell line A549／GR of human lung adenocarcinoma and investigate the mechanism of drug resistance.Then，to find a reversal agent parthenolide to reverse A549／GR drug resistance.MethodsThe gefitinib resistant cell line A549／GR was established by a method of repeated treatment with high dose of gefitinib for a short period and followed by low but gradually increasing concentrations of the drug.The drug resistance index was determined by MTT assay，and the expression levels of drug resistant related protein MDR and ABCG2were detected by the Western blotting assay.The reversal factor of parthnolide in A549／GR cells was measured by MTT assays.The cell apoptosis was detected by AnnexinV FITC staining and the apoptosis related proteins surviving and Bcl－2were detected by Western blotting analysis.ResultsThe resistance index of A549／GR to gefitinib was 18.7.The expression levels of the drug resistance－related protein MDR and ABCG2were obviously increased in A549／GR cells.Parthenolide effectively reversed drug resistance of A549／GR，with a reversal factor 8.66.Importantly，parthenolide potently induced A549／GR cell apoptosis and inhibited expression of anti－apoptotic protein surviving and Bcl－2.ConclusionA drug－resistant cell line A549／GR expressing typical drug－resistant proteins was established.Parthenolide can reverse the drug－resistant cells by inducing apoptosis of A549／GR cells.

lung neoplasms；drug resistance；apoptosis；revesal agent；targeted therapy

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.001

A

1671－8348（2012）35－3689－03

国家重点基础发展计划（973计划）项目（2010CB529401）。 △

，Tel：2062789442；E－mail：shaxiaohh＠hotmail.com。

2012－06－09

2012－08－22）

·论 著·