胆红素对L－02细胞凋亡以及Bcl－2及Bax体外表达影响的研究

陈兆夷，陈兆武，王光明，邓衍部，刘有理，黄志刚

（1.安徽省宣城市人民医院消化内科 242000；2.安徽医科大学基因重点实验室，合肥230022）

胆红素对L－02细胞凋亡以及Bcl－2及Bax体外表达影响的研究

陈兆夷1，陈兆武2，王光明1，邓衍部1，刘有理1，黄志刚1

（1.安徽省宣城市人民医院消化内科 242000；2.安徽医科大学基因重点实验室，合肥230022）

目的探讨胆红素对健康人肝细胞系L－02凋亡的影响及Bcl－2、Bax基因对凋亡过程的调节。方法将不同浓度的胆红素（终浓度分别为0、100、150、200、250、300mg／L）作用于体外培养的健康人肝细胞L－02，采用流式细胞仪和碘化丙啶（PI）双标等技术观察细胞的凋亡率和免疫组织化学方法检测细胞凋亡状态及凋亡相关基因Bcl－2、Bax蛋白的表达。结果Bcl－2蛋白的表达，对照组为阴性表达，低浓度组弱阳性表达，高浓度组强阳性表达。Bax蛋白的表达，对照组可见表达，低浓度组表达增多，高浓度组明显增多，强阳性表达。表明Bcl－2蛋白表达越强，凋亡指数越少；Bax蛋白表达越强，凋亡指数越强。结论Bcl－2、Bax蛋白均参与了胆红素所诱导的L－02细胞凋亡的调节，并在细胞凋亡的发生、发展中起重要作用。

胆红素；细胞凋亡；L－02细胞系；Bcl－2；Bax

笔者在前期研究中证明，高胆红素作用可导致L－02细胞先发生凋亡，随后部分凋亡细胞发生继发性坏死，其程度与胆红素浓度呈显著正相关［1］。关于胆红素对L－02细胞凋亡的机制及Bcl－2与Bax表达在其过程中的意义，笔者进行了后续研究，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 胆红素、DMEM培养基为美国Gibco公司产品；小牛血清为杭州四季青生物制品有限公司产品。

1.2 主要仪器 采用倒置荧光显微镜（德国LEICA公司），FACSCalibur型流式细胞检测仪（美国BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 胆红素标准液的配制［2］精确称取胆红素20mg，溶于稀释血清80mL（其中血清和生理盐水的比例是1∶24），加4mL二甲亚砜（DMSO）和2mL碳酸钠（Na2CO3）（0.1mol）制成浓度为200mg／L（342μmol／L）的胆红素溶液。每次实验前胆红素溶液均新鲜配制，所有实验步骤均在弱光下进行，以防止胆红素转变为其同分异构体。

1.3.2 细胞培养 健康人肝细胞系L－02细胞购于南方医科大学，L－02细胞接种于体积分数15%胎牛血清、青链霉素各100U／mL和谷氨酰胺2mol／L的DMEM培养液中，置37℃、5%CO2、95%湿度条件下的培养箱中培养，平均每2～3天换液、传代1次，实验时使用指数生长期细胞。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 应用不同浓度胆红素溶液作用12h后收集各组细胞（1×106／mL），0.25%胰酶37℃消化细胞，至缩呈圆形，收集细胞入离心管离心（1 000r／min，10min），弃上清液，冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，200μL结合缓冲液轻轻重悬细胞。加入10μL Annexin－V异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），4 ℃避光孵育 30 min。加入300μL结合缓冲液和5μL浓度为20μg／mL的碘化丙啶（propidium iodide，PI）轻轻混匀，立即上机检测。检测在安徽省立医院中心实验室完成。

1.3.4 胆红素对人肝细胞L－02Bcl－2、Bax蛋白表达的影响将L－02细胞（1×106／mL）接种于6孔板中进行细胞爬片，细胞贴壁后应用不同浓度胆红素溶液作用24h（终浓度分别为0、100、150、200、250、300mg／L）；弃上清液后用PBS洗2次并用多聚赖氨酸固定玻片；每张片加1滴过氧化氢酶阻断溶液（试剂A），室温下孵育20min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗4min 3次。去除PBS，滴加动物血清（试剂B）封闭，室温下孵育20min，清除非特异性吸附，以降低非特异性背景着色。擦去多余血清，滴加一抗Bcl－2（工作液），室温下孵育3～4h，PBS冲洗4min 3次。滴加生物素化二抗工作液（试剂C），室温下孵育20min，PBS冲洗4min 3次。去除PBS，滴加链霉菌抗生物素蛋白一过氧化酶（试剂D），室温下孵育20 min，PBS冲洗4min 3次。去除PBS，滴加DAB显色液染色3 min。水洗终止，苏木素染色，自来水冲洗返蓝。脱水干燥，透明，封片，光镜下观察，照相。判断标准：按染色强度评分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，染色强度需与背景色相对比。

1.4 统计学处理 采用PEMS3.1for Windows统计软件进行分析，经方差齐性检验，各组方差齐，采用方差分析，组间两两比较采用q检验；各组方差不齐，采用秩和检验；判断两数值变量间有无直线相关关系，及其相关方向和程度，采用相关分析法检验，结果用±s表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胆红素诱导L－02细胞凋亡率变化 经流式细胞仪检测，凋亡的L－02细胞分布在左上区，而正常细胞为FITC和PI均低染，分布在流式细胞分析图的左下区。早期凋亡细胞以Annexin V－FITC染色为主，在流式细胞分析图的右下区，晚期凋亡细胞则Annexin V－FITC和PI双染色，位于流式细胞分析图的右上区。本研究结果表明，胆红素能诱导L－02细胞凋亡，细胞凋亡率与胆红素浓度呈浓度－效应关系（图1）。相关分析表明，细胞坏死数量与胆红素浓度之间无明显相关（r＝0.515 6，P＝0.295 2），但细胞凋亡数量与胆红素浓度之间呈显著相关（r＝0.885 2，P＝0.019 0）。

图1 流式细胞仪检测不同浓度胆红素作用L－02细胞12h后的凋亡的变化

2.2 免疫组织化学法检测 Bcl－2、Bax蛋白的表达 Bcl－2在300mg／L组偶见棕黄色颗粒状，呈散在、弱阳性表达，200mg／L组与300mg／L组相比较阳性细胞数增多，染色加深，呈黄褐色表达，见封3图2～4。

Bax主要在肝细胞胞浆呈棕黄色颗粒状；0mg／L组未见阳性表达，200mg／L组可见肝细胞散在、弱阳性表达，较150 mg／L组有所增强，阳性细胞数增多，250mg／L组阳性染色进一步加深，阳性细胞多，300mg／L组肝细胞弥漫阳性染色，染色加深，阳性细胞数增多，见封3图5～7。

3 讨 论

细胞凋亡是细胞有序而协调激活凋亡刺激基因和凋亡抑制基因共同控制的过程［3］。在线粒体调控细胞凋亡的体系中，Bcl－2、Bax是线粒体膜蛋白中最重要的代表。Bcl－2、Bax比例失调可能是肝细胞凋亡增加的原因之一［4］。Bcl－2基因是目前最受关注的与细胞凋亡相关的基因之一。Bcl－2基因蛋白表达产物定位于线粒体膜、核膜和内质网，任其氨基酸C－末端由19个氢基酸残基组成的疏水性片段，并借此与膜相连。通过转基因动物和基因转染实验研究发现，Bcl－2对细胞凋亡具有明显的抑制作用［5］。目前，已发现多种与Bcl－2同源的基因，如Bclxl、Bcl－xs、Bax基因等［6］。这些基因构成了Bcl基因家族，在体内Bcl－2基因家族的成员可以具有两种截然不同的功能，Bax基因是今年来新发现的一种凋亡促进基因，属Bcl－2同一家族。Bcl－2保护线粒体的完整性，抑制细胞色素C的释放，而Bax在线粒体膜上形成多聚体影响其完整性，使线粒体释放Caspase活化因子（如细胞色素C等）并进入胞浆中，诱发Caspase家族表达引起的细胞凋亡［7］。Bax蛋白的氨基酸序列有21%与Bcl－2同源，有3种不同的编码蛋白Bax－α、Bax－β及Bax－γ。Bax基因具有拮抗 Bcl－2抑制凋亡的作用。Bcl－2及Bax蛋白都是均一的二聚体，反应时需一个分子Bcl－2及一个分子Bax结合，形成异二聚体，结合后的蛋白才具有调节功能［8］。Bax／Bcl－2的比值，对于决定细胞接受刺激信号后存活与否起关键作用。Bcl－2过量表达（Bcl－2－Bcl－2），细胞存活；Bax过量表达（Bax－Bax）细胞死亡。

本研究证实，在高浓度胆红素时Bcl－2不表达或少量表达，肝组织出现细胞凋亡明显增加；在低浓度胆红素时，Bcl－2大量表达，出现肝组织细胞凋亡明显减少而表明，Bcl－2的表达起到了抑制肝细胞凋亡的作用。Bax明显高表达时，体外胆红素作用L－02细胞凋亡明显增多，同时，Bcl－2蛋白表达越强，凋亡指数就越少；Bax蛋白越强，凋亡指数就越高。表明Bcl－2和Bax蛋白均参与了体外胆红素作用于L－02细胞凋亡的调节，Bcl－2起抑制凋亡的作用，Bax起促进凋亡的作用，他们在高胆红素时所致肝损害的发生、发展中起着重要作用。

本研究应用凋亡定性（DNA片段、Hoechst33258荧光染色）分析获取凋亡的直接证据和定量（流式细胞仪）对细胞凋亡进行观察；也分别从凋亡的早期（PI－Annexin V双染色法）和晚期（DNA片段）检测；免疫组化法进一步检测胆红素处理肝细胞24h后Bcl－2与Bax的表达水平的变化。综合分析结果，为高胆红素血症可以诱导健康人肝细胞的凋亡，并呈良好的剂量－效应关系。这种现在也许就可以用高胆红素血症诱导肝细胞凋亡，部分的解释“胆酶分离”现象高死亡率的原因。与以往对于肝脏衰竭的发生是肝细胞的急性大量死亡不能为细胞增生所补偿的结果的认识有所改变。本研究结果提示，高胆红素血症的时候，凋亡是肝细胞的第一反应，而坏死则往往出现于细胞凋亡之后，肝细胞的凋亡过程对随之出现的肝细胞坏死的行程起着至关重要的作用。也许可以试着从抑制细胞凋亡这个源头来治疗肝衰竭。在胆红素到达一定水平时，给予积极的预防凋亡等治疗以防止肝细胞进一步坏死。通过对Bcl－2、Bax基因的进一步深入研究，有望为探讨胆红素诱导L－02细胞凋亡的发生机制以及在高胆红素血症所指肝损害发生、发展中所其的作用提供理论依据。

［1］陈兆夷，陈兆武，李胜联，等.体外胆红素对L－02细胞生长与凋亡的影响［J］.第三军医大学学报，2010，24（32）：2656－2658.

［2］Berns M，Toennessen M，Koehne P，et al.Ibuprofen augments bilirubin toxicity in rat cortical neuronal culture［J］.Pediatr Res，2009，65（4）：392－396.

［3］Spfick MR，Walczak H.The interplay between the bcl－2 family and death receptor－mediated apoptosis［J］.Biochem Biophys Acta，2004，1644（2／3）：125－132.

［4］Di Nardo A，Benassi L，Magnoni C，et al.Ceramide 2（N－acetyl sphingosine）is associated with reduction in bcl－2 protein levels by Western blotting and with apoptosis in cultured human kerationocytes［J］.Dermatol，2000，143（3）：491－497.

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A research of the influence of bilirubin on the apoptosis of L－02 cell line and the expression of Bcl－2 and Bax

Chen Zhaoyi1，Chen Zhaowu2，Wang Guangming1，Deng Yanbu1，Liu Youli，Huang Zhigang1
（1.Department of Gastroenterology and Hepatlolgy，The People′s Hospital of Xuancheng City，Xuancheng，Anhui 242000，China；2，Department of Laboratory Medicine，Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230032，China）

ObjectiveTo investigate the influence of bilirubin on the apoptosis of L－02cell line in healthy human liver，and investigate the regulation of Bcl－2and Bax on the apoptosis process.MethodsThe L－02cells cultured in vitro and treated with bilirubin with the concentration 0，100，150，200，250，300mg／L respectively.The growth and apoptosis of L－02cell was assessed by flow cytometry Annexin V and PI；the expression of gene Bcl－2and Bax were detected by immunohistochemistry.ResultsImmunohistochemistry showed a negative expression of Bcl－2in the control group，a weak positive expression in the low concentration group and a strong positive expression in the high concentration group；and a visible expression of Bax in the control group，an increased expression in the low concentration group and a significantly increased strong positive expression in the high concentration group.This indicates that the expression of Bcl－2has a negative corelation with apoptotic rate nevertheless the Bax expression has a positive corelation.ConclusionBcl－2and Bax could regulate the apoptosis of L－02cell line induced by bilirubin and play an important role in the occurance and development of cell apoptosis.

bilirubin；apoptosis；L－02cells；Bcl－2；Bax

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.010

A

1671－8348（2012）35－3713－02

2012－06－13

2012－09－12）

·临床研究·