镁锌合金促成骨细胞增殖作用及其相关机制研究＊

刘 波，潘 琦，王希明，田启俊，周华江，潘 锋

（1.山东省济南市第四人民医院骨三科 250031；2.中国医科大学生物材料研究室，辽宁沈阳110001）

镁锌合金促成骨细胞增殖作用及其相关机制研究＊

刘 波1，潘 琦1，王希明1，田启俊1，周华江1，潘 锋2

（1.山东省济南市第四人民医院骨三科 250031；2.中国医科大学生物材料研究室，辽宁沈阳110001）

目的观察镁锌合金（Mg－Zn）共同培养对成骨细胞MC3T3－E1的促增殖作用及相关的作用机制。方法实验分为对照组、Mg－Zn组、聚L－丙交酯（PLLA）组。采用细胞毒实验（MTT）法检测细胞增殖活性，酶联免疫分析（ELISA）法检测整合素β2的表达变化，免疫印迹法（Western blotting）检测细胞BMP－2和p－Smad1蛋白的表达变化。结果培养到第2天，3组间细胞增殖活性差异无统计学意义（P＞0.05）。第4、6、8、10天时，Mg－Zn组 MC3T3－E1细胞增殖显著高于对照组和PLLA组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组与PLLA组细胞增殖活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。3组 MC3T3－E1细胞整合素β2的表达在第2、4、6天逐渐升高，第8天又逐渐减低，差异有统计学意义（P＜0.05），在同一时间点Mg－Zn组整合素β2的表达显著高于对照组和PLLA组，差异有统计学意义（P＜0.01），对照组和PLLA组之间整合素β2的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论Mg－Zn共培养可以促进成骨细胞的增殖，上调整合素β2的表达和激活BMP／Smad信号通路能是其主要的作用机制。

整合素类；Smad蛋白质类；镁锌合金；骨修复；骨形成蛋白；Smad蛋白

生物可降解的镁锌合金（Mg－Zn）具有好的机械学特性和生物相容性，在医学领域得到了广泛的应用研究，例如心血管的可降解支架、骨的固定材料等［1－2］。近期的研究显示，Mg－Zn材料不仅有良好的生物相容性，还可以促进成骨和化股过程，其相关的作用机制研究极少［3］，因此，本研究将 Mg－Zn材料与成骨细胞混合培养，观察Mg－Zn对成骨细胞的促生长作用，并探讨其相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 成骨细胞MC3T3－E1在37℃、5%CO2条件下培养于低糖DMEM培养液中（10%胎牛血清、青霉素和链霉素各100IU／mL），并分为对照组、Mg－Zn组、聚 L－丙交酯（PLLA）组。青霉素、链霉素购于美国Sigma公司，胎牛血清购于美国Gibco公司公司，DMEM培养基为广州英韦创津公司产品，生物可降解Mg－Zn为上海奥芮济医疗科技有限公司产品，聚L－丙交酯（PLLA）由长春圣博玛生物材料有限公司提供，人β2整合素酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒购自上海希美生物科技有限公司，BMP－2、p－Smad1、GAPDH 抗体购自美国Santa Cruz公司，HRP标记二抗购自上海康成生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖实验 MC3T3－E1细胞接种到96孔板（400／孔），3组分别于培养2、4、6、8、10d时，加入0.5mg／mL二甲基四氮唑蓝（MTT），检测细胞的增殖活性，以酶标仪570nm波长处测定的吸光度（A）值为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线。

1.2.2 整合素β2的检测 MC3T3－E1细胞接种到6孔板（1×105／孔），3组分别于培养2、4、6、8、10d时取培养液上清液，严格按着整合素β2ELISA试剂盒说明操作，酶标仪450nm波长处测定测定各孔的A值，以A值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，然后对照标准曲线计算出整合素β2的浓度。

1.2.3 目的蛋白的免疫印迹法（Western blotting）检测MC3T3－E1细胞接种到6孔板（5×105／孔），48h后，3组分别采用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次，1×SDS上样缓冲液裂解细胞，95℃加热10min，12 000×g离心10min，取上清液，8%～12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），电转移蛋白至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，含5%脱脂奶粉的洗膜缓冲液（TBST）浸润PVDF膜1h封闭非特异性结合，加入特异性的一抗（1∶1 000）4℃过夜，加入1∶5 000稀释的二抗室温1h，化学发光，X线曝光。扫描曝光胶片，Bio Rad凝胶成像仪分析软件测定各蛋白条带密度值，目的蛋白与内参磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的比值为蛋白表达相对定量值。

1.3 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，两样本比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Mg－Zn对 MC3T3－E1细胞增殖活性的影响 3组对MC3T3－E1细胞的增殖活性显示，在第2天时，3组间细胞增殖活性差异无统计学意义（P＞0.05），到第4、6、8、10天时，Mg－Zn组细胞增殖显著高于对照组和PLLA组，差异有统计学意义（P＜0.05），对照组和PLLA组细胞增殖活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明 Mg－Zn可以促进 MC3T3－E1细胞的增殖，见图1。

图1 3组成骨细胞MC3T3－E1的增殖活性

表1 3组MC3T3－E1细胞整合素β2表达（±s，μmol／L）

表1 3组MC3T3－E1细胞整合素β2表达（±s，μmol／L）

＊：P＜0.01，与对照组和PLLA组比较。

组别 第2天 第4天 第6天 第8天 第10天对照组 0.31±0.06 0.85±0.26 0.91±0.28 0.65±0.18 0.53±0.09 PLLA 组 0.37±0.05 0.94±0.21 1.04±0.33 0.71±0.15 0.61±0.10 Mg－Zn组 0.64±0.13＊1.67±0.34＊1.62±0.41＊1.21±0.17＊1.08±0.16＊

2.2 Mg－Zn对 MC3T3－E1细胞整合素β2表达的影响 3组MC3T3－E1细胞整合素β2的表达在第2、4、6天逐渐升高，第8天又逐渐减低，差异有统计学意义（P＜0.05）；在同一时间点Mg－Zn组MC3T3－E1细胞整合素β2的表达水平高于对照组和PLLA组，差异有统计学意义（P＜0.01），对照组与PLLA组之间整合素β2的表达，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 Mg－Zn对 MC3T3－E1细胞BMP－2和p－Smad1表达的影响

与对照组比较 Mg－Zn组显著升高了 MC3T3－E1细胞BMP－2的表达，随后Smad1蛋白的磷酸水平也相应地出现了升高，而PLLA并没有显现出激活BMP／Smad通路的活性，见图2。

3 讨 论

近年来生物可降解的骨内固定材料在骨科中的应用已成为研究的热点，生物可降解的Mg－Zn内固定材料因其强度和塑韧性均强于可降解的陶瓷或聚合物材料，故而受到更多学者的关注［4－5］。镁和锌是体内含量丰富的不可缺少的重要金属元素，对机体多个系统的生长发育具有重要的影响，因此，Mg－Zn内固定材料不仅不会释放有毒离子，而且其释放的镁、锌金属离子反而会促进成骨细胞的增殖和分化［6－8］。本研究显示，Mg－Zn与成骨细胞 MC3T3－E1共培养可以促进细胞的增殖，而另外一个生物可降解吸收骨内固定材料PLLA没有发现这个现象，说明Mg－Zn可以促进骨折的愈合。

整合素是细胞黏附的一个重要调节蛋白，调节着细胞的增殖和分化。本研究显示，与PLLA组相比Mg－Zn组可以促进成骨细胞MC3T3－E1高表达整合素β2蛋白，Mg－Zn组表面比PLLA组粗糙，而粗糙的表面也是刺激整合素表达的一个因素，但其具体的机制还有待进一步的研究［9－11］。骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）能诱导成骨细胞和软骨细胞的分化成熟，在骨的修复中起到重要作用，BMPs的缺失会导致骨折的不愈合和骨缺损，BMPs通过磷酸化Smad蛋白，使p－Smad蛋白入核发挥转录因子的作用，激活下游靶基因的表达调控骨和软骨的生成［12］。本研究显示，Mg－Zn共同培养可以上调 MC3T3－E1细胞BMP－2和p－Smad蛋白的表达，说明Mg－Zn共同培养可以激活BMP／Smad信号通路。

综上所述，Mg－Zn共同培养可以促进成骨细胞的增殖，其作用机制可能与上调整合素β2的表达和激活BMP／Smad信号通路相关。

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The study on effect of magnesium zinc alloy on the proliferation of osteoblasts＊

Liu Bo1，Pan Qi1，Wang Ximing1，Tian Qijun1，Zhou Huajiang1，Pan Feng2
（1.Third Department of Orthopedic，the Fourth People′s Hospital of Jinan City，Shandong250031，China；2.Department of Biological Materials，China Medical University，Shenyang，Liaoning110001，China）

ObjectiveTo observe the effect of magnesium zinc（Mg－Zn）alloy on the proliferation of MC3T3－E1osteoblasts，and to study its action mechanisms.MethodsThe treatment was divided into three group：control group，Mg－Zn alloy group，PLLA group.The activity of cells proliferation was measured by MTT analysis.The protein level of integrinβ1was determined by ELISA assay.Western blot was used to detect the protein expression of BMP－2and p－Smad1，respectively.ResultsThere were no significant difference among 3groups in the second day（P＞0.05）；in the fourth，sixth，eighth and tenth day，the proliferation of MC3T3－E1cells in Mg－Zn alloy group was significantly higher than that in control group and PLLA group（P＜0.05）；there were no statistics significance of the proliferation in control group and PLLA group（P＞0.05）；the expression of cell integrinβ2in 3groups increased gradually in the second，fourth and sixth day and decreased gradually in the eighth day and showed statistic significance（P＜0.05）；at the same point of time，the expression of cell integrinβ2of Mg－Zn alloy were significantly higher than the that in control group and PLLA group（P＜0.01）；there were no statistic significance in the difference of the expression of cell integrinβ2between control group and PLLA group（P＞0.05）.ConclusionMg－Zn alloy significantly promoted the proliferation of osteoblasts.The upregulation of the expression of integrinβ2and in stimulation of BMP／Smad pathway are the main action mechanisms.

integrins；smad proteins；Mg－Zn alloy；bone repair；bone morphogenetic proteins

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.018

A

1671－8348（2012）35－3732－02

国家自然科学基金资助项目（81000791）。

2012－06－13

2012－09－12）

·基础研究·