耐培美曲塞人肺癌细胞系的建立

杨 民，王 峻，孟丽娟，刘福银，樊卫飞，蒲骁麟

0 引 言

肺癌是目前世界上常见的肿瘤相关性死亡原因，已居我国肿瘤发病及死亡原因首位［1］。现阶段不能手术的中晚期非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)仍采用以化疗为主的综合治疗，但耐药性的出现使得NSCLC的化疗疗效下降，故对于耐药基因的研究日益受到重视。本实验通过体外诱导肺腺癌细胞株A549对培美曲塞产生获得性耐药，建立A549培美曲塞耐药株，为研究肺腺癌中培美曲塞的耐药机制及耐药相关基因的探讨提供模型。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌细胞株A549购于美国标准生物品收藏中心。培养基为含10%胎牛血清的DMEM;培养条件:37℃，5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱;2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。细胞培养所需培养基、胎牛血清、胰酶等均为Gibco公司产品;MTT为Sigma公司产品;培美曲塞为法国礼来公司产品。

1.2 方法

1.2.1 MTT法测 A549的 IC50 将细胞按5×103/孔接种于96孔板，24 h后加入10－2μg/L的培美曲塞，采用 MTT 法［2］分别于培养 24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h和72 h计算出其抑制率。将不同时间点测定的抑制率输入SPSS统计软件包，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，找出曲线平台期(曲线变平坦)，该时间点作为最佳时间点。按上述相同的方法接种96孔板，24 h后加入不同浓度的培美曲塞(10－1～l0－8μg/L)，在最佳时间点处终止培养，按上述相同的方法在Dynateeh-MR7000仪上测定各孔570 nm波长处A值，再使用SPSS统计软件包计算IC50，以所测得IC50浓度为中点，分别以5倍浓度梯度向两侧各延伸3个浓度梯度，以此浓度梯度为加药浓度，共接种21个孔，每个浓度3孔，再以上述方法重新测出IC50。最后取3个平行孔的均值。

1.2.2 耐药的诱导 以1/2 IC50浓度的培美曲塞诱导细胞60 h，转化为完全培养基培养，隔天换液，无菌PBS冲洗以去除死细胞，待细胞状态稳定后，继续加入1倍IC50浓度的培美曲塞诱导细胞60 h，隔天换液除去死细胞，待细胞状态稳定后，再以上述方法重新测IC50，并重复上述步骤，直到IC50达到诱导耐药前的5倍时，即视为获得性耐药诱导成功，收集细胞进行下一步实验，并计算耐药指数RI(resistance index):

1.2.3 生长曲线和倍增时间测定 分别取对数生长期的正常A549和耐药A549细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以3×104/孔种植于24孔板，常规培养，分别于 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 进行计数，每次取3孔计数，计算其平均值，绘制生长曲线。根据Patterson公式计算对数生长期的倍增时间:

1.2.4 克隆形成率检测 取生长良好的正常A549和耐药A549细胞，消化计数，按每平皿400个细胞的浓度种植于直径35 mm的平皿中，每组接种3个平皿，培养14 d后取出观察，弃培养液，固定台盼兰染色，计数＞50个细胞的克隆数，计算克隆形成率，并计算其平均值:

1.2.5 统计学分析 数据采用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差()表示，2组均数比较用t检验，以P≤0.05为差异有显著性统计学意义。

2 结 果

2.1 培美曲塞作用A549的IC50测定 根据不同时间点药物对细胞的抑制率曲线，计算出药物与细胞的最佳作用时间约为48h。按上述方法将细胞按5×103/孔接种于96孔板，24 h后分别加入不同浓度(10－1～10－8μg/L)的培美曲塞，培养 48 h，计算各浓度的抑制率，计算其IC50为2.75×10－3μg/L。以2×10－3μg/L为基点，5倍浓度差分别向左右延伸，再次计算其IC50，并取3个平行孔的均值，得出A549对培美曲塞的 IC50 为(3.24±0.43) ×10－3μg/L。

2.2 耐药的诱导 经上述方法诱导耐药约3个月，测得其 IC50为(4.8±0.87) ×10－2μg/L，耐药指数为(14.81±1.47)。与A549细胞相比，差异有显著性统计学意义，P＜0.05。在普通培养液中传代6周，其耐药性稳定，耐药指数无明显下降，认为耐药诱导成功。

2.3 A549/Pemetrexed生物学特性

2.3.1 药敏试验 MTT法检测 A549/Pemetrexed对吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、5氟脲嘧啶、顺铂、卡铂的耐药性，详见表1。

表1 A549和A549/Pemetrexed的细胞药敏结果Table 1 Drug sensitivity of A549 and A549/pemetrexed

2.3.2 生长曲线和倍增时间测定 图 1显示A549/Pemetrexed和A549细胞增殖速度接近，倍增时间分别为(63.03 ±0.98)h和(62.63 ±1.23)h(P＞0.05)，表明A549/Pemetrexed产生耐药后其生长未受明显影响。

图1 A549/Pemetrexed和A549细胞的生长曲线Figure 1 Growth curves of A549 and A549/pemetrexed

2.3.3 克隆形成率检测 图2显示在不同浓度的培美曲塞(10－6～1μg/L)中培养48h细胞克隆形成率，其中A549/Pemetrexed显示出较高的耐药性，克隆能力未受到太大影响。

图2 A549/Pemetrexed和A549细胞的克隆形成率Figure 2 Cloning efficiency of A549 and A549/pemetrexed

3 讨 论

培美曲塞是2004年美国食品与药品管理局批准应用于临床的多靶叶酸拮抗剂，作用靶点包括嘧啶和嘌呤合成中的多种酶［3］，对晚期非小细胞肺癌有较好的疗效［4］。Scagliotti等［5］应用培美曲塞/顺铂和吉西他滨/顺铂方案治疗1725例非小细胞肺癌，发现培美曲塞/顺铂与吉西他滨/顺铂方案的总生存率相似，但不良反应更低。Gronberg等［6］报道培美曲塞/卡铂联合方案在体力状况评分=2或年龄＞75岁老年人中取得较好的疗效，且不良反应可耐受。Peterson等［7］的研究则发现培美曲塞治疗非鳞形细胞肺癌时较鳞形细胞肺癌有更好的疗效。故目前培美曲塞可作为老年进展期非鳞形NSCLC的一线治疗方案。但随着化疗的进程，其治疗后耐药性的产生影响了其最终疗效［3］。因此，建立耐培美曲塞肺癌细胞模型对于阐明耐药机制，提出预测疗效、逆转耐药的有效策略具有较好的现实意义。

目前，肿瘤细胞耐药细胞系的建立多采用药物浓度递增诱导法或高浓度间歇诱导法进行诱导建株［8］。但2种方法各有优缺点，前者剂量浓度较难把握，而后者历时则较长。本研究将2种方法相结合，以培美曲塞对A549进行诱导。经反复作用，A549/Pemetrexed株的耐药指数达(14.81±1.47)，并能稳定生长传代，同时对吉西他滨、5氟脲嘧啶、顺铂、卡铂产生耐药。A549/Pemetrexed与A549在生长曲线、倍增时间等方面相近，在克隆形成等方面存在差异。因此，本研究建立的A549/Pemetrexed细胞系可用于耐药相关基因的检测，为进一步对培美曲塞耐药机制及相关基因的研究提供实验模型。

［1］肖鑫武，宋 勇，朱 虹，等.全身PET/CT在非小细胞肺癌预后判断中的价值［J］.医学研究生学报，2010，23(12):1257-1260.

［2］禹立霞，谢 丽，魏 嘉，等.6种中药提取物对胃癌细胞株细胞毒作用及多西紫杉醇增敏作用的研究［J］.医学研究生学报，2010，23(9):962-966.

［3］Hagner N，Joerger M.Cancer chemotherapy:targeting folic acid synthesis［J］.Cancer Manag Res，2010，2:293-301.

［4］Vilmar AC，Sorensen JB.Customising chemotherapy in advanced nonsmall cell lung cancer:daily practice and perspectives［J］.Eur Respir Rev，2011，20(119):45-52.

［5］Scagliotti G，Parikh P，von Pawel J，et al.PhaseⅢ study comparing cisplatin plus gemcitabine with cisplatin plus pemetrexed in chemotherapy-naive patients with advanced-stage NSCLC［J］.J Clin Oncol，2008，26(21):3485-3486.

［6］Gronberg BH，Bremnes R，Aasebo U，et al.Pemetrexed plus carboplatin versus gemcitabine plus carboplatin in the treatment of stage IIIB/IV NSCLC［J］.J Clin Oncol(Meeting Abstracts)，2007，25(Suppl 18):S7517.

［7］Peterson P，Park K，Fossella FV，et al.Is pemetrexed more effective in patients with non-squamous histology.A retrospective analysis of a phase III trial of pemetrexed vs docetaxel in previously treated patients with advanced NSCLC［J］.Eur J Cancer Suppl，2007，5(Suppl 4):S363.

［8］Davidson J D，Ma L，Flagella M，et al.An increase in the expression of ribonucleotide reductase large subunit 1 is associated with gemcitabine resistance in non-small cell lung cancer cell lines［J］.Cancer Res，2004，64(11):3761-3766.