生长抑素受体在胆囊癌组织中的表达

郭润生，史佩东，陈跃宇

0 引 言

胆囊癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，发病率占消化道肿瘤第5位。胆囊癌早期常无特殊症状，进展迅速，误诊率高，手术切除率低，术后5年生存率低于5%［1］。为了提高患者的生存率，应早期诊断胆囊癌、早期发现转移灶及提供多样的更为有效的治疗手段。生长抑素(somatostatin，SS)是一种生长激素释放抑制激素，通过结合细胞表面SSTR而起作用。SSTR是由7个特异性跨膜片段组成一个多肽链构成的G蛋白受体家族，SSTR表达于多种人类原发性肿瘤［2－3］。本文应用免疫组化的方法检测SSTR蛋白在原发性胆囊癌及正常胆囊组织中的表达，以期为胆囊癌的诊断治疗提供有利的帮助。

1 资料与方法

1.1 病例资料 收集上海嘉定区中心医院及上海新华医院普外科2000年1月至2011年10月住院手术治疗的胆囊癌患者29例，有完整的临床病理学资料，术前均无放疗、化疗和激素治疗。组织学类型均为腺癌。所有标本均经病理学检查确诊。具体资料见表1。另收集25例正常胆囊组织(胆囊炎、胆囊结石患者)，对29例胆囊癌组织和25例正常胆囊组织进行免疫组化染色。

表1 肿瘤标本临床资料Table 1 Clinical data on the tumor specimens

1.2 仪器及试剂 德国Leica切片机及显微镜，400倍普通光学显微镜及德国莱卡生产的DMRQ55O病理图像分析仪，普通电冰箱、普通高压锅、烤箱、玻片，孵育盒，免疫组化笔，青岛医疗仪器一厂的恒温箱。实验用SSTR1－3多克隆抗体(兔抗人IgG)购自上海博士德公司，SSTR4－5多克隆抗体(兔抗人IgG)购自上海晶美公司，SP试剂盒为通用型，二抗为羊抗兔IgG，其中试剂A:封闭用山羊血清工作液，试剂B:生物素标记的羊抗兔IgG，试剂C:辣根酶标记链霉素卵蛋白素工作液;0.01 mol PBS(PH=7.4)清洗液;柠檬酸抗原修复缓冲液，3%过氧化氢溶液;4%甲醛溶液固定;DAB显色试剂盒。实验方法按照试剂盒说明操作。

1.3 操作方法 组织标本经4%甲醛固定，常规石蜡包埋;以切片机制成4 μm厚切片;二甲苯脱腊20 min，3 次;梯度酒精水化:100%－100%－95%－95%－75%各5min;3%H2O2孵育5min去除内源性过氧化物酶;蒸馏水洗 5 min;SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5进行抗原修复;SSTR1无需修复;切片置于盛有EDTA修复液中，微波10 min，取出后静置冷却20 min。修复液配置:0.5 mol/L Tris－HCl 20 ml，0.5 mol/L EDTA PH 8.02ml，加800ml蒸馏水，混均，用 NaOH调节至 PH7.8～8.0，再用蒸馏水补至1000 ml;取出切片，TBS冲洗2～3次，将标本周围的缓冲液檫干;滴牛血清白蛋白10～15 min，降低背景，封闭非特异性的结合;加一抗，室温孵育 1.5～2 h;SSTR1，SSTR2 及 SSTR31∶100，SSTR4 及 SSTR51∶2500;二抗孵育:TBS缓冲液冲洗切片2～3次，滴加二抗室温30 min;TBS缓冲液冲洗切片2～3次;DAB显色:取1 ml蒸馏水，加50 μl溶液A，混均，再加溶液B50 μl，混均，室温下孵育2～10 min，显微镜观察显色情况，显色好即用流水冲洗终止反应;后处理:苏木精衬染细A，细胞核，盐酸酒精分化脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4 染色结果判定 光镜下观察，在良好组织结构和清晰的背景上，免疫组织化学染色阳性反应为棕黄色颗粒。每例随机观察具有代表性的5个高倍镜(×200)视野，根据染色强度和阳性细胞百分数计分。阳性染色位于细胞膜及细胞质，强度分为3级:未染色为0分(阴性)、淡黄色为1分(弱阳性)、黄色为2分(阳性)、棕褐色为3分(强阳性);阳性细胞百分数≤5%为0分，6% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，≥76%为4分。最后两者得分相乘，0～1分判为阴性，≥2判为阳性(2～3分为弱阳性，4～5分为阳性，≥6分为强阳性)。免疫组化结果由2位病理科医师确认。

1.5 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件包进行统计分析，率的比较采用Fisher精确概率检验。以P≤0.05为有统计学意义。

2 结 果

5种SSTR亚型阳性表达主要分布于细胞质和细胞膜，见图1，呈棕黄色颗粒状，SSTR在胆囊癌组织中的表达:SSTR1(62.1%)，SSTR2(13.8%)，SSTR3(82.6%)，SSTR4(24.1%)，SSTR5(69%);正常胆囊黏膜中的表达:SSTR1(44%)，SSTR2(12%)，SSTR3(64%)，SSTR4(16%)，SSTR5(24%)。从以上数据中可以看出SSTR3在2组SSTR中的表达均为最高，在正常胆囊组织中的SSTR1的表达高于SSTR5，而在胆囊癌组织中的表达与此相反。在以上2种组织中SSTR2的表达均是最低的。SSTR5表达在胆囊癌组织比在正常胆囊组织黏膜明显增加(P=0.045)，其余差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2，表3。

表2 SSTR在胆囊癌中的表达情况［n(%)］Table 2 Expressions of SSTR subtypes in gallbladder cancer n(%)

表3 SSTR在正常胆囊组织(胆囊炎及胆囊结石)中的表达情况［n(%)］Table 3 Expressions of SSTR subtypes in the non-cancerous gallbladder tissue(cholecystitis and cystic calculous)n(%)

图1 SSTR在胆囊癌组织中的表达Figure 1 Expressions of SSTR subtypes in the cancerous gallbladder tissue

3 讨 论

生长抑素(somatostatin，SST)是一种环状的多肽类激素，最初是从下丘脑分离出来的，因为能抑制垂体释放生长激素而得名，广泛存在于人体的内分泌和外分泌系统中，具有广泛的生物学效应。SST存在2种分子形式，即14肽生长抑素(SS－14)和28肽生长抑素(SS－28)，这2种形式不仅结构相似，其生物学活性也相似，主要表现为可抑制多种内分泌、外分泌细胞的功能，调节胆道和胃肠道的运动，以及可作为神经递质调节大脑的运动和识别功能。另外，SST 还可广泛地抑制细胞增殖活性［4－5］。研究发现生长抑素具有抑制胆囊癌细胞株GBC－SD的增殖、诱导凋亡等作用［6－7］。近年来，SST 抗肿瘤细胞增殖效应及人工合成的生长抑素类似物(somatostatin analogue，SSTA)的临床应用，受到越来越多学者的关注。

生长抑素及其类似物多种生物学活性的发挥是通过靶细胞膜上的特异性受体即SSTR介导的［8］。目前已发现5种SSTR亚型，分别命各为SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4和SSTR5。长效生长抑素主要通过与SSTR2、3和5结合而发挥作用。不同配体与不同亚型受体的亲和力不同，不同亚型受体介导的受体后作用亦不同。因此，肿瘤组织SSTR表达情况是影响药物疗效的关键。然而，具有抗肿瘤效应的SSTR并非在所有的胆囊癌患者的肿瘤组织上表达。研究表明不同个体的表达谱和表达水平可能决定生长抑素类似物治疗胆囊癌的疗效。通过分析SSTR的表达对胆囊癌进行选择性治疗可能能提高治疗的应答率及效果。

本研究采用免疫组化法对人胆囊癌及正常胆囊组织SSTR亚型的蛋白表达进行了检测，发现在上述组织中SSTR1～5均有不同程度的表达。在胆囊癌及正常胆囊组织中的优势表达亚型均为SSTR3，其次是 SSTR1及 SSTR5，表达最少的是 SSTR2亚型。SSTR1、SSTR3、SSTR5的表达在胆囊癌组织中均高于正常胆囊组织，且SSTR5的表达增高具有明显差异性;而SSTR1及SSTR4的表达在癌与正常胆囊组织中无明显变化。近年研究证实，SSTR2和SSTR3为介导SSTA抗肿瘤作用的主导亚型，SSTR家族中与细胞凋亡关系密切的SSTR亚型目前认为是SSTR2和 SSTR3［9］。因此，肿瘤组织中是否有SSTR2和SSTR3的表达，应当成为患者是否接受SSTA治疗的前提。所以治疗胆囊癌应该以SSTR3为靶点。

SSTR5的表达在胆囊癌与正常胆囊组织中具有明显的差异性，在正常胆囊到癌的过程中，SSTR5的表达明显增高，故SSTR5有可能做为胆囊癌诊断的一个辅助指标。

［1］De Aretxabala X，Losada H，Mora J，et al.Neoadjuvant chemoradiotherapy in gallbladder cancer［J］.Rev Med Chil，2004，132(1):51－57.

［2］Hal1 GH，Turnbul1 LW，Richmond I，et al，Localisation of somatostatin and somatostatin receptors in benign and malignant ovarian tumors［J］.Br J Cancer，2002，87(1):86－90.

［3］王少华，于泽平，李 宁，等.原发性乳腺浸润性导管癌组织中生长抑素受体表达及其预后价值［J］.医学研究生学报，2008，21(11):1172 －1174.

［4］Reubi Jc，Schaer JC，Markwalder R，et al.Distribution of somatostatin receptors in normal and neoplastic human tissues:recent advances and potential relevance ［J］.Yale J Bio Med，1997，70(5－6):471－479.

［5］Patel YC.Somatostatin and its receptor family.Frontiers in Neuroendocrinology［J］.1999，20(3):157－198.

［6］秦一雨，李济宇，李松岗，等.生长抑素对胆囊癌细胞株的致凋亡研究［J］.中华肝胆外科杂志，2009，15(1):45－48.

［7］全志伟，李济宇.生长抑素对胆囊癌细胞生长周期的影响［J］.外科理论与实践，2003，8(1):56－58.

［8］Bläker M，Schmitz M，Gocht A，et al.Diferential expression of somatostatin receptor subtypes in hepatocellular carcinomas［J］.J Hepatol，2004，41(1):112－118.

［9］Susini C，Buscail L.Rationale for the use of somatostatin analogs as antitumor agents［J］.Ann Oncol，2006，17(12):1733－1742.