响应面法优化奶酪酶解工艺条件的研究

王 蓓，曹雁平，郑福平，高 尚，陈 云，李鹏宇

(1.北京工商大学食品学院，北京 100048; 2.北京工商大学北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048; 3.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

响应面法优化奶酪酶解工艺条件的研究

王 蓓1，2，曹雁平1，3，郑福平1，高 尚1，陈 云1，李鹏宇1

(1.北京工商大学食品学院，北京 100048; 2.北京工商大学北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048; 3.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

在单因素实验的基础上，采用蛋白酶Flavourzyme和Neutrase组合，在允许pH自然变化的条件下，水解切达奶酪制备乳滋味增强物质。利用主成分分析方法结合响应面分析确定得到酶解奶酪制备乳滋味增强组分的最佳工艺条件为:Flavourzyme酶添加量为3.5%(w/w)，Neutrase酶添加量为2.25%，水解温度45℃，pH 8.0，水解时间为7.6h水解液的滋味综合评价指标分值最高为60.93。在该条件下制备得到的水解液具有较浓郁的奶滋味，风味较佳，无苦味和异味，并且其浓厚味滋味评分结果明显高于脱脂纯鲜牛奶样品。

切达奶酪，复合蛋白酶水解，乳滋味增强物质，响应面分析

近年来我国乳品行业迅速发展，奶酪以其独特的风味和极高的营养价值越来越为广大消费者所关注。浓缩奶酪风味剂是奶酪风味配料的一种，以酶改性奶酪(Enzymatic Modified Cheese，EMC)为代表的奶酪风味剂，其制备方法是在一定反应条件下，以不同的乳制品作为底物，向其中添加具有不同酶解特异性的酶制剂(主要是水解酶类)，从而迅速制备得到具有浓郁风味的奶酪风味剂［1－2］。奶酪风味剂既可以添加在再制奶酪、奶酪风味型产品或其他奶酪中，以生产出具有特定风味的不同奶酪产品;也可以作为食品配料，部分或完全代替成熟奶酪添加到其他食品中，以减少成熟奶酪的使用量，从而降低产品的生产成本［3－5］，因而应用十分广泛。目前国内对乳蛋白水解的研究方向主要集中在各种乳蛋白活性肽的制备方面，而对于乳蛋白水解产物对风味贡献方面的研究还较少［6－7］。本研究在单因素实验的基础上，以奶酪为底物，将肽含量和滋味评定两个评价指标结合统计学分析方法，对复合蛋白酶水解奶酪得到的奶酪增味物质的工艺条件进行了进一步优化，为国内奶酪风味剂的研究与开发提供进一步的理论依据，具有重要的实际意义［8］。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

切达奶酪 当地超市，产地美国;复合蛋白酶(Neutrase，酶活(1.14±0.32)×104U/g，pH6.0，50℃下测定，简称N酶)、复合风味蛋白酶(Flavourzyme，酶活(2.00±0.19)×104U/g，pH7.0;50℃下测定，简称F酶) 食品级，诺维信中国投资有限公司;脱脂纯鲜牛奶 上海光明购自超市。

电子恒速搅拌器 上海沪西分析仪器厂;超级恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解产物制备 取一定量的奶酪在特定的初始pH、温度及固定的搅拌转速下进行酶解反应，反应一段时间后于85℃灭酶活15min后终止反应，待反应物冷却后取适量水解产物，用12%的三氯乙酸(TCA)处理后离心取上清液，测定其肽含量。

1.2.2 奶酪酶解最佳工艺条件确定 在单因素实验的基础上，选定初始pH为8.0，反应温度为45℃，底物浓度为4%(w/v)的条件下，以F酶添加量，N酶添加量和酶解反应时间3个因素作为自变量，以酶解生成肽百分含量和酶解产物滋味评分作为响应值，根据Box－Behnken［9］中心组合设计原理，设计三因素三水平的二次回归方程来拟合因素和响应值之间的函数关系，采用响应面分析法分析各因素间的交互作用，并确定最佳的酶解条件。因素和水平见表1。

表1 酶法水解乳蛋白的因素水平表Table 1 Factors and levels of hydrolyzed cream protein orthogonal experiment

1.2.3 肽百分含量计算 肽百分含量的测定采用Fox等人检测奶酪成熟指标的12%TCA－N的测定方法并加以改进［10］。准确移取搅拌均匀的酶解液2.5m L，加入25m L质量分数为12%的TCA溶液，再用20m L的缓冲液充分冲洗，悬浮液在4000r/min的离心机中离心20min，取上清液进行微量凯氏定氮测定，并将酶解过程中生成的肽占总氮的百分含量定义为肽百分含量，用以衡量水解程度，其计算方法见式(1):

式中:TCAN－酶解过程中生成肽百分含量(%); TCAN'－酶解后反应产物中总肽的含量(mg/m L); TCAN0－酶解前反应物中总肽的含量(mg/m L);总N含量－反应物中总N含量(mg/m L)。

1.2.4 酶解产物滋味评分实验 将纯鲜脱脂牛奶样品作为对照样品，酶解样品离心除去上层脂肪层后冻干，将冻干粉按照0.2mg/m L的浓度添加到脱脂复原乳中作为待测样品，并通过水浴加热保持样品温度在50℃左右。请12名感官评价员比较待测样品与对照样品中浓厚感差别，以八分标度法对其浓厚味强度进行标度检验，并将脱脂纯鲜牛奶样品的浓厚味强度定义为4分［11－12］。具体评分条件如下:无浓厚感1分，浓厚感与对照样品比不明显2分，浓厚感略低于对照样品3分，浓厚感与对照样品相似为4分，浓厚感比对照样品略增强为5分，浓厚感比对照样品较明显增强6分，浓厚感比对照样品明显增强7分，浓厚感显著增强8分。样品随机三位数编号打乱顺序后交给评价员品评，同一个样品每名评价员品评三次(不在1d内)，然后取平均值作为该评价员对于此样品的评分，最后将该样品的12次评分值平均，即为其滋味评分分值。

1.2.5 酶解方式 蛋白酶Neutrase是内切酶，且活力较高，因而单独使用时酶解程度较大，易生成苦味肽使其奶酪酶解产物感官品质下降。蛋白酶Flavourzyme是一种用于在中性或微酸性条件下水解蛋白质的真菌蛋白酶与肽酶的复合体，它包含有内切蛋白酶和外切肽酶两种活性，可以用来脱除高度水解度产物的苦味，同时也可以用于彻底水解蛋白质，增进和改善水解液的风味。由于单独使用Flavourzyme时，酶解产物的感官滋味虽然略有增加，但由于其本身活力较低，滋味改变不明显。因而为了克服上述问题，本实验采用两种蛋白酶复合酶解奶酪的作用方式。

2 结果与分析

2.1 复合酶酶解乳蛋白条件的优化

三氯乙酸是一种蛋白质沉淀剂，因此三氯乙酸可溶性氮含量的高低，表明了蛋白质酶解程度的高低，此外这一指标也是奶酪成熟程度的一种标志。12%TCAN中的成分主要是小分子肽和游离氨基酸。因此12%TCAN可以作为衡量蛋白酶解程度的指标，用于评价水解蛋白产物中的肽含量［13］。

复合蛋白酶水解奶酪制备乳滋味增强产物的响应面分析结果见表2，将表2中的两个评价指标用主成分分析法，利用SPSS 13.0数据处理软件进行分析［14］，得到客观权重为生成肽含量a=0.3577，滋味评分b=0.6423;并给其各自赋以主观权重:A=0.4; B=0.6，由此得到主客观结合的权重:

水生态文明建设扎实推进。印发《实行最严格水资源管理制度考核办法》，水资源管理考核制度初步建立，水资源配置能力不断提升，水资源管理控制指标体系基本建立，最严格水资源管理制度试点建设加快实施。水生态文明制度建设逐步推进。确定46个全国水生态文明试点城市。累计完成80余个全国节水型社会试点建设。国家水资源监控能力建设项目进展顺利。水土保持补偿机制建设扎实推进。生态清洁型小流域建设力度进一步加大。

生成肽含量:0.4a/(0.4a+0.6b)=0.2717

滋味评分:0.6b/(0.4a+0.6b)=0.7283

因此综合评价指标F=0.2717×肽含量+0.7283 ×滋味，计算结果见表2。

2.2 回归分析

采用Design－Expert®6数据处理软件对表2中的实验结果进行响应面回归分析，得到回归方程:

根据综合评价指数F的回归方程可以得到在实验选定范围内关于F酶的添加量(X1，%)、N酶的添加量(X2，%)、酶作用时间(X3，h)这三个因素的交互项对综合评价指数F函数关系的响应面所对应的等高线图(图1)。由图1可知，在选定范围内，随着酶解时间和N酶添加量的增加，综合评价指标均是先增大后减小，其中综合指标F值较高的区域在X2为1.5%～2.5%和X3为6～10h之间;并且随着F酶的添加量变化到4.5%以上时，综合评价指标下降较为迅速，因而含有外切蛋白酶活力的F酶对综合评价指标的影响比较显著;此外由图1(c)可知，在选定的范围内，综合评价指标较高值落在X1和X2较为居中的条件下。当两酶的添加量都高时，底物的酶解程度较高，生成肽的百分含量较高，但感官评价值较低，因而最终的综合评价指标值反而下降。综上所述可以得到F酶的添加量X1在3.5%～4.5%以及N酶的添加量X2在1.5%～2.5%之间时酶解产物的综合评价指标F值最高。

表2 响应面分析设计及评分指标Table 2 Program and experimental results of response surfacemethodology

表3 响应面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadraticmodel

2.3 最佳酶解条件的确定及验证

对回归方程求极值，得到当 X1=3.5%;X2= 2.25%;X3=7.6h时综合评价指标取得最大值为59.49。因此最佳的实验条件为 F酶的添加量为3.5%，N酶的添加量为2.25%，两酶共同作用时间为7.6h。在此最佳条件下，进行验证实验，测得此时的生成肽百分含量为52.7%，滋味评分值为64，感官评价浓厚味显著，计算得到综合评价指标为60.93，与回归的结果59.49基本一致，说明该回归方程可以用于实际。

图1 复合酶水解乳蛋白酶解过程中综合评价指标的等高线图Fig.1 The response surface plots and contourmaps of the effects on synthesized evaluation index during the hydrolysis process

3 结论

本研究在允许自然pH变化的条件下，利用主成分分析结合响应面分析法确定得到酶解奶酪制备乳滋味增强组分的最佳工艺条件为:F酶添加量为3.5%，N酶添加量为2.25%，水解温度45℃，pH8.0，水解时间为7.6h时水解产物的综合评价指标值最高为60.93。在该条件下所得到的水解液有较浓郁的奶滋味，无苦味和异味，并且其浓厚味感官评分结果明显高于脱脂纯鲜牛奶样品。因此本研究中得到的奶酪酶解产物可作为奶酪风味剂直接添加入各种乳制品中，起到增强乳滋味的作用，此外还可以配合其它香原料用于调配各种天然牛奶或奶酪香精。

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Optim ization of the hydrolyzed Cheddar cheese condition by the response surface analysis

WANG Bei1，2，CAO Yan－ping1，3，ZHENG Fu－ping1，GAO Shang1，CHEN Yun1，LIPeng－yu1
(1.School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University Beijing 100048，China; 2.Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University(BTBU)，Beijing 100048，China; 3.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology and Business University(BTBU)，Beijing 100048，China)

Based on the sing le factors results，the enzyme combination of Flavourzyme and Neutrase were em p loyed to hyd rolyze Cheddar cheese and get the enhanced m ilky materials as thoroughly as possib le.The p rincipal com ponent analysis and the response surface method were app lied to get the op tim um operational conditions of enzymatic combinations.The experimental results ind icated that the op timum conditions were the dose of Flavouzyme 3.5%(w/w)and Neutrase 2.25%(w/w)，reac tion tem perature 45℃，starting pH 8.0，and the reaction time was 7.6h.Under such experimental cond itions，the whole synthetic index value was 60.93.Compared w ith the commercial skim m ilk the hyd rolysate had the higher score in the taste of sensory evaluation and without any bitterness.

Cheddar cheese;enzymatic hyd rolysis;enhanced m ilky materials;response surface analysis

TS252.54

A

1002－0306(2012)12－0197－04

2012－01－11

王蓓(1981－)，女，博士，讲师，主要从事乳制品风味方面的研究。

国家“863”计划项目(2011AA100903);北京工商大学青年教师科研启动基金资助项目。