食品级微生物降解双酚A的研究

沈丽金，刘新杰，姚卫蓉

(江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

食品级微生物降解双酚A的研究

沈丽金，刘新杰，姚卫蓉*

(江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

以食品级微生物为目标，筛选得到6株对双酚A有降解效果的菌种。针对其中的罗伊式乳杆菌，详细研究了培养条件对双酚A降解效果的影响，发现当培养基中双酚A浓度1000μg/kg、初始pH6.5、接种量0.1%，37℃下培养32h后的降解率可达69.90%。说明该菌具有较好的双酚A降解特性。

双酚A，食品级微生物，罗伊式乳杆菌，降解

双酚A，全称4，4－二羟基二苯基丙烷(BPA)，是一种重要的化工原料，主要用于生产聚碳酸酯、环氧树脂、聚砜树脂、聚苯醚树脂、不饱和聚酯树脂等多种高分子材料。而双酚A具有明显的雌激素效应，以及一定的生殖毒性［1］，特别是研究发现双酚A作为塑料奶瓶的原材料可能会影响婴幼儿的生长发育［2－3］。2008年，加拿大首先将双酚A列入有毒化学物质，并禁止用于婴幼儿奶瓶中［4］。我国卫生部发布公告，自2011年6月起禁止双酚A奶瓶的生产，9月起禁止进口含双酚A的婴幼儿奶瓶。人们也在试图寻找双酚A的控制手段。目前，对于双酚A的控制方法大致分为微生物降解、化学方法、物理吸附。曾有报道从污水处理厂污泥中分离得到木糖氧化无色杆菌，在培养基体系中得到最大降解率为46.93%［5］。经河水里分离得到的铜绿色假单胞菌显示出90%的降解效率［6］。除了细菌，白腐真菌在自然白洋淀水中6d可以将双酚A完全降解［7］。也有人利用紫外光降解双酚A，降解率可达到97%［8］。到目前为止，关于双酚A的微生物降解展开的研究并不少，但多集中于致病菌和非食品级菌种，如恶臭假单胞菌、新鞘氨醇杆菌、白腐真菌、木糖氧化无色杆菌等［5－6，9－10］。本文针对在食品包装材料使用过程中已经迁移进入食品的双酚A，以食品级微生物为目标筛选双酚A的高效降解菌，并研究其最优降解条件，探索在食品加工过程中采用食品级微生物降解已有污染物的方法，也为研究传统发酵食品加工过程中原有微生物对化学污染物的原位降解提供借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

瑞士乳杆菌、罗伊式乳杆菌、短乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种、干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌等菌株 本实验室自行筛选、分离、纯化得到，并经过鉴定;基础培养基 葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，牛肉浸取物(牛肉膏)10.0g，酵母提取液(酵母膏或酵母粉)5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二胺2.0g，吐温－80 1.0m L，磷酸氢二钾2.0g，无水硫酸镁0.283g，一水合硫酸锰0.189g，蒸馏水1.0L。

固相萃取柱 C18柱 LC－C18SPE小柱，规格为500mg、3m L/50pcs，上海安谱公司的CNWBOND。

1.2 含双酚A培养基的制备

为了双酚A溶解，先配制90%的乙醇，称取一定量的双酚A纯品，溶解，得到双酚A乙醇溶液，并用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌;为了使双酚A充分溶解于培养基中，又避免过量的乙醇对菌种的生长代谢造成一定的影响，双酚A乙醇溶液和配制好的基础培养基按照1∶20(V∶V)的比例混合，得到含双酚A培养基，培养基中双酚A的含量参照GB9685－2008食品包装材料特定迁移量的规定以600μg/kg为基准，按照具体实验操作作适当调整。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的活化 按0.2%的接种量接种，37℃下培养24h为一代，培养两代为活化完全。活化好的菌种接种到双酚A培养基中摇床培养。

表1 六种食品级微生物对双酚A的降解效果Table 1 The degradation of BPA from six food－degree strains

1.3.2 微生物降解双酚A及其影响因素的研究

1.3.2.1 微生物降解双酚A的培养过程 配制不同浓度的双酚A培养基(150～1200μg/kg)接种一定量的活化菌种，在不同的初始pH下，以120 r/m in振荡速度摇瓶培养一定时间后，测定培养液中双酚A的残留量W1。以不接菌的含双酚A培养基为空白对照，双酚A的含量记为W0。

1.3.2.2 培养时间的影响 配制培养基浓度为600μg/kg，调节初始pH为6.5，取活化后的菌种，按照0.2%的比例接种，在120r/min的摇床中，37℃培养，以不接菌的培养基为空白对照。每隔4h取样，待处理。

1.3.2.3 初始浓度的影响 按照倍比稀释的方法，分别配制1200、600、300、150μg/kg浓度的双酚A培养基，调节初始pH为6.5，取活化好的菌种，按照0.2%的接种量接种，在37℃下，120r/min的转速摇床培养，32h后终止培养，取样，待处理。以不接菌的底物作为空白对照，在相同的条件下培养并测定BPA浓度。

1.3.2.4 初始pH的影响 配制一定量的浓度为1000μg/kg的双酚A培养基，分装，用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH溶液调节pH，配制成pH为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0的培养基，取活化好的菌种，按照0.2%的接种量接种，以不接菌的底物作为空白对照，均在37℃下，120 r/m in的转速摇床培养，32 h后终止培养，取样，待处理。

1.3.2.5 接种量的影响 配制基础培养基，调节pH为6.5，加入双酚A溶液，得到BPA浓度为1000μg/kg的双酚A培养基，取活化好的菌种，按照接种量为0.03%，0.07%，0.1%，0.2%，0.3%，0.5%，0.8%，1.0%进行接种，以无菌水补足接种量不同造成的体积差。以不接菌的底物作为空白对照，在37℃下，120 r/m in的转速摇床培养，32h后终止培养，取样，待处理。

1.3.2.6 温度的影响 配制BPA浓度为1000μg/kg的双酚A培养基，调节pH为6.5，取活化好的菌种，按照接种量为0.1%的量进行接种，分别在不同温度(25、30、37、40℃)下，以不接菌的培养基为空白对照，120r/min的转速摇床培养，32h后终止培养，取样，待处理。

1.3.3 培养液中双酚A的提取与净化 经微生物发酵得到的培养液经8000r/min、4℃离心10min，收集上清液;再采用固相萃取C18小柱萃取纯化培养液中的双酚A。

C18小柱在萃取前需要进行活化。用6m L甲醇和6m L超纯水依次分别以5m L/m in的速度活化C18柱;活化后取20m L培养上清液，以5m L/m in的流速流经柱子，使双酚A吸附到柱子上;用6m L甲醇(10%)以5m L/m in流速冲洗小柱，去除杂质;分别两次用3m L甲醇以5m L/m in流速洗脱双酚A，收集洗脱液，进行HPLC检测。

1.3.4 双酚A含量的测定 待测液采用高效液相色谱法测定［11］。

液相色谱测定条件:symmetry C18色谱柱，进样量5μL，流速1.0m L/m in，流动相:乙腈∶水(45∶55);荧光检测器，激发波长:227nm，吸收波长:313nm。

峰面积(X)与双酚A浓度(Y)的关系:Y(μg/ kg)=15.557X－35.622，相关系数R2=1.0000。

1.3.5 双酚A降解率的计算 降解率(%)=(W0－W1)/W0×100

其中，W1是实验样品双酚A残留量;W0为空白对照组双酚A含量。

2 结果与讨论

2.1 双酚A降解菌种的筛选

活化好的菌种按照0.2%的量接种到双酚A培养基(650μg/kg)中，37℃摇床培养，48h后取出，检测并计算降解率。三次平行实验结果如表1。

由表1可见，6株食品级微生物菌株对双酚A都有一定的降解效果，其降解率从20%到65%不等。其中短乳杆菌降解双酚A前后的HPLC图谱如图1所示，在11.10m in左右的出峰即是BPA的峰，a、b分别表示空白对照及降解后的峰。图1中b的峰高明显偏低，BPA的峰面积减少，说明BPA含量降低了。综合看来，降解效果最佳的菌种为罗伊式乳杆菌。因此选择罗伊式乳杆菌作为进一步实验用菌种。

图1 短乳杆菌降解双酚A的HPLC图谱(48h)Fig.1 The HPLC chromatography of degradation of Bisphenol A by Lactobacillusbrevis(48h)

实验因批次问题，HPLC检测采用的C18柱的型号不同，造成BPA出峰时间不同，但每批次检测均以BPA标准品测定为对照，实验结果具有可靠性。

2.2 双酚A时间降解曲线的研究

由图2表示罗伊式乳杆菌的双酚A降解趋势，随着时间的延长，双酚A含量不断减少，在32～40h后双酚A含量趋于平稳。考虑到实验周期及有效性，选取32h作为降解时间点。图3所示为32h点的菌种降解HPLC图谱。

图2 双酚A的时间降解曲线图Fig.2 Time－course degradation of bisphneol A

图3 罗伊式乳杆菌降解双酚A的HPLC图谱(32h)Fig.3 The HPLC chromatography of degradation of bisphenol A by Lactobacillusreuteri(32h)

2.3 培养液初始pH对BPA降解的影响

由图4所示，菌种降解双酚A的最适pH范围在6～7之间，其降解效率达到50.01%。pH过高过低都将影响菌种的降解效率，当pH为5和9时，其降解效率分别为20.78%和16.08%。推测可能是pH过高或过低影响菌代谢过程中酶的活性，抑制或使酶部分失活，导致降解性能降低。

图4 培养液初始pH对双酚A降解的影响Fig.4 The effect of pH on the BPA degradation

2.4 装液量对BPA降解的影响

装液量是影响培养基中溶氧量从而影响菌种生长及降解效果的一个间接因素。本实验在250m L锥形瓶中分别加入50、100、150、200m L的培养液。

根据图5所示结果，装液量为50～100m L之间，降解性能较好，达到61.12%，且处于平缓趋势，装液量大于100m L，双酚A降解效率趋于下降。装液量过大，可能导致培养基溶氧量下降，间接影响菌种对双酚A的降解效率。

2.5 接种量对BPA降解的影响

由图6可知，接种量从0.03%到0.07%，双酚A降解率呈快速上升趋势。种量从0.07%到0.2%范围内，降解效果较好，在接种量为1.0%时，降解效果最佳，降解率为63.00%。当接种量为达0.2%时，双酚A降解率下降至58.68%。推测当接种量较少时，菌种在一定时间内繁殖有限，影响整个培养基中双酚A的降解率。而当接种量超过一定范围，菌种繁殖过多，可能造成营养匮乏，相对于降解双酚A能力有一定下降。

图5 装液量对双酚A降解的影响Fig.5 The effect of liquid volumn on the BPA degradation

图6 接种量对双酚A降解的影响Fig.6 The effect of inoculation rate on the BPA degradation

2.6 初始浓度对BPA降解的影响

图7表明当培养体系中 BPA浓度从 150～600μg/kg，双酚A降解率逐渐上升，到达65.76%，而从600～1200μg/kg的浓度范围，双酚A的降解率稍有上升，但趋势平稳。因此，600～1200μg/kg的双酚A浓度为降解较优浓度范围，在此，选择1000μg/kg进行下一步实验。

图7 初始浓度对双酚A降解的影响Fig.7 The effect of initial concentration of BPA on the BPA degradation

2.7 温度对BPA降解的影响

如图8所示，在37℃下的双酚A降解最好，达到69.60%，在35～37℃范围内，双酚A的降解率差别较小，降解效果较好。随着温度的上升，双酚A降解率直线下降，菌种的长势也大幅下降。而温度低于35℃，双酚A的降解率也逐渐下滑，在25℃时，双酚A的降解率只有12.81%。温度的过高、过低都将直接影响菌株的生长情况，进而可能影响其产生双酚A分解酶，从而影响双酚A的降解效率。

图8 培养温度对双酚A降解的影响Fig.8 The effect of culture temperature on the BPA degradation

2.8 最佳条件下菌种降解情况

选取上述最适宜条件，pH为 6.5，装液量为100m L，接种量为0.1%，BPA初始浓度为1000μg/kg，37℃摇床(120 r/m in)培养32h，实验结果如图9所示。BPA随着降解时间的延长，浓度不断下降，在20～30h之间降解速率较快，在32h时，BPA降解率达到69.60%，32h以后BPA浓度稍有降低，但趋于缓慢。pH从初始值慢慢下降，在24h后基本达到平衡，维持在4.05左右。菌种OD值的变化与pH变化呈一定的相关性，在24h后达到平衡，维持在2.15左右。

图9 最佳条件下罗伊式乳杆菌降解、生长曲线与pH变化图Fig.9 Time－course degradation of BPA、growth curve of Lactobacillusreuteri and variation curve of pH under the best culture conditions

3 结论

本论文筛选得到可以降解双酚A的高效菌株，分别是瑞士乳杆菌、罗伊式乳杆菌、短乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种、干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌。经实验优化，罗伊式乳杆菌在双酚 A浓度为600～1200μg/kg，pH为6～7，接种量为0.07～0.1%，装液量为50～100m L，温度为35～37℃时，双酚A的降解效率较高。在最佳条件下，pH为6.5，装液量为100m L，接种量为0.1%，BPA初始浓度为1000μg/kg时，37℃摇床(120r/min)培养32h后，降解率达到69.60%。

筛选出来的菌种降解能力较强，可以应用于包装材料中双酚A的降解，具有较好的实际应用前景。

［1］贺天锋，陈奕.双酚A生殖毒性研究进展［C］.华东地区第十次流行病学学术会议论文集.安徽:中华疾病控制杂志，2010:586－590.

［2］潭松.双酚A与挤奶机安全性的讨论［C］.首届中国奶业大会论文集.北京:中国乳业，2010:392－395.

［3］王文枝，国伟，孙利，等.婴儿奶瓶及食品包装材料中双酚A的风险评估［J］.食品科技，2008，33(1):197－199.

［4］成晓瑜.加拿大卫生部:罐装食品中不存在双酚A风险［J］.农业工程技术:农产品加工业，2010，9:53－55.

［5］Lobos JH，Leib T K，Su T M.Biodegradation of bisphenol A and other bisphenols by a gram－negative aerobic bacterium［J］. Appl Environ Microbiol，1992，58(6):1823－1831.

［6］Kang J H，Katayama Y，and Kondo K.Biodegradation or metabolism of bisphenol A:from microorganisms tomammals［J］. Toxicology，2006，217:81－90.

［7］郭超，赵慧敏，全燮，等.白洋淀水中白腐真菌对双酚A的降解规律及降解途径［J］.环境污染和防治，2009，31(2): 4－13.

［8］Wang R，Dianjun Ren D，Siqing Xia S，et al.Photocatalytic degradation of Bisphenol A(BPA)using immobilized TiO2and UV illumination in a horizontal circulating bed photocatalytic reactor (HCBPR)［J］.Hazardous Materials，2009，169:926－932.

［9］王文增，赵文晋，黎娜，等.恶臭假单胞茵对沉积物中双酚A的降解及产物分析［J］.安全与环境学报，2009，9(5): 70－73.

［10］Yamanaka H，Moriyoshi K，Ohmoto T，et al.Efficient microbial degradation of bisphenol A in the presence of activated carbon［J］.Bioscience and Bioengineering，2008，105(2): 157－160.

［11］龚清杰.固相萃取－高效液相色谱法测定水源水中痕量双酚A［J］.环保科技，2010，12(2):27－30.

Study on the degradation of bisphenol A by food bacteria

SHEN Li－jin，LIU Xin－jie，YAO Wei－rong*
(School of Food Science＆Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

Six strained were screened which could degrade bisphenol A based on food－degrade strains.One of them，Lactobacillusreuteriwas selected for further study，and the effect of the culture conditions on the BPA degradation were studied.It showed that when the concentration of bisphenol A was 1000μg/kg，pH was 6.5，tem perature was 37℃，inoculation rate was 0.1%，the ratio of BPA degradation could reached 69.60%after 32h of culture.

b isphenol A;food－g rade bacteria;Lactobacillusreuteri;deg radation

TS201.3

A

1002－0306(2012)12－0210－04

2011－08－31 *通讯联系人

沈丽金(1987－)，女，硕士在读，研究方向:食品安全与质量控制。

“十一五”国家科技支撑计划重点项目(2009BADB9B04);中央高校基本科研业务费专项资金(JUSRP21124，30908，31005和31106)。