复合酶法提取红雪茶粗多糖工艺优化研究

杨蓉生，陈炼红，唐俊妮，陈 娟，唐艳琼

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)

复合酶法提取红雪茶粗多糖工艺优化研究

杨蓉生，陈炼红*，唐俊妮，陈 娟，唐艳琼

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)

为了获得复合酶法提取红雪茶粗多糖的最佳工艺，采用单因素实验和正交实验，研究了不同料液比、pH、酶解温度、提取时间和不同复合酶配比对红雪茶粗多糖提取率的影响;在此基础上采用L9(34)正交实验研究了各影响因素对红雪茶粗多糖提取率的影响，结果表明复合酶最佳配比为纤维素酶2.0%，果胶酶2.0%，木瓜蛋白酶0.5%;影响红雪茶粗多糖提取率的四个因素的主次顺序为:料液比＞酶解温度＞pH＞酶解时间;最佳提取工艺条件是料液比1∶40，pH4.5，酶解温度40℃，酶解时间80min，在此条件下红雪茶多糖提取率达8.91%。本研究确定了复合酶法提取红雪茶多糖的最佳工艺。

复合酶法，红雪茶，多糖，提取

红雪茶是生长于雪域高原海拔4000m以上的苔藓植物，属地衣类地茶科植物，学名地茶。雪茶中的红雪茶又名金丝茶［1］。红雪茶性凉、味甘，富含雪茶酸、鳞片酸、羊角衣酸、甘露醇、氨基酸、维生素和微量元素，经药检安全无毒副作用［2］。经现代医学研究表明，红雪茶富含大量人体必须的微量元素，具有降血脂、降胆固醇、清心开窍、补血养心等功效，对高血压、冠心病、肥胖症、神衰体弱等有明显作用［3］。目前对红雪茶化学成分的研究比较多［4］，但对其活性成分的提取报道很少。对红雪茶多糖的浸提，仅采用了水提、醇提法［2］，目前还没有关于酶法提取工艺的相关研究文献。本实验采用复合酶(纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶)提取多糖法［5－8］，主要研究料液比、酶解温度、酶解时间、pH以及各种酶的配比对红雪茶多糖提取率的影响，通过单因素、正交实验确定最佳的工艺条件，该方法具有条件温和、易除杂质、效率高、对多糖结构和活性影响小等优点，为红雪茶综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红雪茶 四川西部甘孜高原，经烘干磨碎成粉;无水乙醇、蒽酮、浓硫酸、磷酸氢二钾、柠檬酸、葡萄糖、蒸馏水均为分析纯;纤维素酶 BR，15U/mg，上海伯奥生物科技有限公司;木瓜蛋白酶 BR，650U/mg，北京奥博星生物技术有限公司;果胶酶 500U/mg，成都市科龙化工试剂厂。

delta320型pH计、AL204型电子天平 梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;WFZ UV－2102PSC型紫外可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司; HZS－H型恒温水浴锅 哈尔滨市东明医疗器械厂制造;F－W－100型高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司;DHG－9203A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;TUS－S2A型旋转蒸发器 上海鹰迪仪器设备有限公司;AKHL－Ⅲ－24型台湾艾柯超纯水机 成都康宁实验专用纯水设备厂;XW－80A型旋涡混合器 上海青浦沪西仪器厂;5804R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司;TD4A型台式低速离心机 长沙英泰仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红雪茶的提取工艺 雪茶粉→溶解→复合酶水解→升温→灭酶→离心→蒸发浓缩→乙醇沉淀→洗涤→低温干燥→粗多糖

1.2.2 操作要点 选择质好的雪茶，洗净后沥干，放入80℃的烘箱中干燥2～3h，粉碎机粉碎，过80目筛，收集雪茶粉，密封备用。

取适量的蒸馏水溶解，40℃水浴30m in，调pH，加入按一定比例混合的纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶的酶溶液，一定温度条件下，在恒温振荡器上提取一定的时间后，沸水灭酶，冷却，4000 r/m in离心15m in，取上清液，用旋转蒸发器浓缩至原体积1/3，加入约5倍体积95%的乙醇沉淀，静置过夜，离心，无水乙醇洗涤，干燥得粗多糖，称重。

1.2.3 标准曲线的制作 精密量取葡萄糖标准品200mg，置于100m L容量瓶中，加水定容。精密吸取10m L，加水定容到100m L容量瓶中，获萄糖标准液。

称取蒽酮0.2g，加入100m L浓硫酸溶解，当日配制使用。

精密量取葡萄糖标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L，分别置于10m L具塞试管中，加蒸馏水至2.0m L，空白管吸取蒸馏水2.0m L，与供试品管做以下同步处理。各管分别加入蒽酮试液8m L，摇匀，浸于冷水浴中冷却，移至沸水浴中加热10min，用水冷却，室温放置10m in，取出在620nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.4 多糖含量的测定 分别称取雪茶粗多糖20mg，置于250m L的容量瓶中，加少量蒸馏水，在沸水浴中快速溶解充分，后于100m L容量瓶中定容至刻度。精密量取2.0m L，按照标准曲线的处理，测定吸光度，代入回归方程，计算出多糖含量。

根据多糖提取率公式计算出红雪茶多糖的提取率。

式中:W1:红雪茶粉重量(mg);W2:粗多糖重量(mg);W3:依据回归方程计算出的多糖重量(mg); 20:红雪茶粗多糖重量(mg)。

1.2.4 红雪茶粗多糖提取单因素实验

1.2.4.1 不同料液比对红雪茶粗多糖提取率的影响

在红雪茶粉水浴30min，pH4.5，复合酶比例1∶1∶1，提取温度40℃、提取时间80m in条件下，分别研究不同的料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)(g∶m L)，对红雪茶多糖的提取的影响，计算提取率。

1.2.4.2 不同pH对红雪茶粗多糖提取率的影响 在料液比为(1.2.4.1的结果)，水浴30m in，复合酶比例1∶1∶1，提取温度40℃、提取时间80m in条件下，分别研究不同料液的pH(3.5、4、4.5、5、5.5、6)对红雪茶多糖的提取的影响，计算提取率。

1.2.4.3 不同酶解时间对红雪茶粗多糖提取率的影响 在料液比为(1.2.4.1的结果)，水浴30m in，pH (1.2.4.2的结果)、复合酶比例1∶1∶1，提取温度40℃条件下，分别研究不同酶解时间(40、60、80、120m in)对红雪茶多糖的提取的影响，计算提取率。

1.2.4.4 不同酶解温度对红雪茶粗多糖提取率的影响 在料液比为(1.2.4.1的结果)，水浴30min，pH (1.2.4.2的结果)、复合酶比例1∶1∶1，酶解时间为(1.2.4.3的结果)的条件下，分别研究不同酶解温度(30、35、40、45、50℃)对红雪茶多糖的提取的影响，计算提取率。

1.2.5 红雪茶粗多糖提取正交实验

1.2.5.1 复合酶配比正交实验 在料液比、pH、酶解时间、酶解温度为单因素实验结果的条件下，研究复合酶的不同用量对红雪茶多糖的提取的影响，设计L9(33)正交实验，确定复合酶的最佳配比。见表1。

表1 复合酶配比因素水平表Table 1 Factors and ratio levels of the complex enzyme

1.2.5.2 提取条件的正交实验 为优化提取工艺，根据单因素及复合酶配比正交实验的实验结果，以料液比、pH、酶解温度、酶解时间为实验因素，设计L9(34)正交实验，确定最佳的提取工艺条件。见表2。

表2 提取条件因素水平表Table 2 Factors and levels of the extraction condition

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

利用蒽酮－硫酸法，测定620nm下的吸光度，绘制标准曲线(图1)。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 The standard curve of Glucose

标准曲线的回归方程为y=7.0857x+0.0352，R2=0.9924，线性关系好。

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对红雪茶粗多糖提取率的影响 由图2可知，多糖的提取率随着料液比(g∶m L)的增加而增加，当料液比大于1∶30时，提取率逐渐降低，故采用1∶30的料液比为宜。

图2 料液比对粗多糖提取率的影响Fig.2 Influence of the solid－liquid ratio on the yield rate of crude polysaccharide

2.2.2 pH对红雪茶粗多糖提取率的影响 由图3可知，多糖的提取率随着pH的增加而增加，但当pH大于5时，粗多糖提取率呈减少的趋势，pH为5时红雪茶粗多糖的提取率最大，当pH大于5.5后，粗多糖提取率会大大的降低。说明pH超出酶的最适pH范围，活力减小。

图3 pH对粗多糖提取率的影响Fig.3 Influence of the pH value on the yield rate of crude polysaccharide

2.2.3 酶解时间对红雪茶粗多糖提取率的影响 由图4可知，当提取时间为60m in时，多糖的提取率最大。酶解时间少于60m in时，随时间的增加，提取率快速增大，而时间超过60m in后，随着时间的延长，提取率快速下降，最后趋于平缓。由此说明，当提取时间为60m in时，酶发挥了最大的作用。因此，当酶解时间为60m in时，红雪茶中粗多糖的提取率最大。

图4 酶解时间对粗多糖提取率的影响Fig.4 Influence of enzymatic hydrolysis time on the yield rate of crude polysaccharide

2.2.4 酶解温度对红雪茶粗多糖提取率的影响 由图5可知，酶解温度低于40℃时，粗多糖提取率随温度升高而增大，而当温度高于40℃时，粗多糖的提取率随温度的升高而呈减少的趋势，酶解温度为40℃，粗多糖的提取率最高。这是由于刚开始随着温度升高，酶反应速度加快，粗多糖的提取率增加，之后随着温度的进一步升高，引起酶蛋白变性失活，酶活力降低，粗多糖提取率降低。

图5 酶解温度对粗多糖提取率的影响Fig.5 Influence of enzymatic hydrolysis temperature on the yield rate of crude polysaccharide

2.3 正交实验

2.3.1 复合酶配比正交实验结果及分析 实验结果见表3所示。因为极差RA＞RC＞RB，所以影响红雪茶多糖提取率的复合酶的顺序为纤维素酶＞木瓜蛋白酶＞果胶酶;空列的RE(代表实验误差包括交互作用的影响)为1.28，RA＞RE，说明中纤维素酶是主要因素，RB＜RE，RC＜RE，说明果胶酶和木瓜蛋白酶在红雪茶多糖提取过程中影响不大。根据各因素的影响大小及正交实验结果，综合分析确定复合酶最佳酶配比为 A3B3C1，即纤维素酶为2.0%，果胶酶为2.0%，木瓜蛋白酶为0.5%。

由于选择的最优水平组合与实际结果不一致，进行验证实验。在最佳酶配比条件下进行，重复3次，多糖提取率分别为8.67%、8.91%、8.70%，则平均提取率为8.76%。

表3 复合酶正交实验结果Table 3 Results of orthogonal test on the complex enzyme

2.3.2 提取条件的正交实验 提取条件的正交实验结果如表4所示。通过提取条件的正交实验结果的极差分析可知，各因素对红雪茶粗多糖提取率的影响程度强弱顺序为:A＞C＞B＞D，即料液比对红雪茶粗多糖提取率影响最大，其次是酶解温度，影响较小的是pH和酶解时间。得出的最佳提取工艺条件为A3B1C2D3，即最佳料液比为1∶40，pH为4.5，温度为40℃，酶解时间为80m in。

在最佳工艺条件下进行提取多糖的验证实验，重复3次，提取率分别为8.86%、8.93%、8.95%，则平均提取率为8.91%。

表4 提取条件的正交实验结果Table 4 Results of orthogonal test on the extraction condition

3 结论

对影响红雪茶粗多糖提取率的因素包括料液比、pH、酶解温度和提取时间等进行了研究，通过单因素实验得出了各因素的最佳水平，即最佳料液比为1∶30，pH为5，酶解温度为40℃，提取时间为60min。

通过对复合酶配比的正交实验，影响红雪茶粗多糖提取率的复合酶的主要因素是纤维素酶，果胶酶和木瓜蛋白酶在红雪茶多糖提取过程中影响不大。确定了酶的最佳配比为纤维素酶2.0%，果胶酶2.0%，木瓜蛋白酶0.5%。

通过对复合酶提取工艺的正交实验，影响红雪茶粗多糖提取率的四个因素的主次顺序为:料液比＞酶解温度＞pH＞酶解时间，即四个因素中对红雪茶粗多糖提取率影响最大的为料液比，其次是酶解温度，其中影响较小的是pH和酶解时间，通过极差分析得出的最佳提取工艺条件最佳料液比为1∶40，pH为4.5，温度为40℃，酶解时间为80m in。

［1］姜北.雪茶化学成分研究［J］.云南植物研究，2002，24 (4):525－527.

［2］陈玉杰，郁建平.雪茶多糖的提取分离及组成研究［J］.济宁医学院学报，2007，30(4):305.

［3］罗岳北，裴月湖.鹿心雪茶的化学成分研究［J］.宁夏医学杂志，2005，27(5):236.

［4］张明.复合酶法提取大青叶中多糖的工艺研究［J］.安徽农业科学，2010，38(26):14352－14353.

［5］黄照南，梁益信，李本锋，等.复合酶法提取香菇多糖的研究［J］.昭通师范高等专科学校学报，2010，32(5):30－32.

［6］王元凤，金征宇.酶法提取茶多糖工艺的研究［J］.江苏农业科学，2005(3):122－124.

［7］葛立军，朱振洪等.正交实验优化复合酶法提取山药多糖工艺研究［J］.时珍国医国药，2010，21(12):3187－3188.

［8］付惠，王立松，陈玉惠，等.云南两种地衣茶白雪茶和红雪茶的营养成分分析［J］.天然产物研究与开发，2005，17(13): 340－343.

Optim ization of polysaccharide extraction fromLethariellaCladonioidesby com pound enzymes method

YANG Rong－sheng，CHEN Lian－hong*，TANG Jun－ni，CHEN Juan，TANG Yan－qiong
(College of Life Science＆Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China)

To ob tain the op tim ized p rocess parameter of extrac ting the polysaccharide fromLethariella Cladonioides，sing le factor experiment and orthogonal testwere adop ted.The effect of different solid－liquid ratio，pH，tem perature of enzymatic hyd rolysi(cellulase，Pectinase，papain)，extrac ting time and com pound enzymes m ixture ratio on the extraction rate of polysaccharide fromLethariellaCladonioideswere studied.The results showed that com pound enzym e best ratio was 2.0%cellulase，2.0%pec tinase，0.5%papain.The im pac t fac tors were as follow ing:solid－liquid ratio＞temperature＞pH＞time.The op tim ized p rocess parameter was solid－liquid ratio 1∶40，pH4.5，tem perature 40℃，time 80m in.Under this cond ition the extrac tion rate of polysaccharide reached to 8.91%.This method was suitab le for polysaccharide extraction fromLethariellaCladonioides.

com pound enzymes;LethariellaCladonioides;polysaccharide;extrac tion

TS201.1

B

1002－0306(2012)12－0285－04

2011－11－18 *通讯联系人

杨蓉生(1959－)，女，实验师，研究方向:畜产品加工。

中央高校基本科研业务费专项(11NZYTH08)。