乙型肝炎病毒YMDD变异与病毒数量和药物治疗时间的关系

徐志勇 陈 婕 肖 荣 朱 凡＊

乙型肝炎是在我国广泛流行，严重危害人民健康的常见传染病。由于乙型肝炎病毒（HBV）聚合酶在催化RNA中间体到DNA负链的逆转录过程中缺少校正活性，使HBV在各种内源性（机体免疫变化）和外源性（药物治疗以及环境影响）压力下，常常发生变异，特别是长期使用抗病毒药物拉米夫定的HBV感染者，其体内可检测到DNA基序酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸（YMDD）204位点突变（rtM204I／V），且常表现为野生株和变异株或是几种变异株共生杂合状态［1］。本文报道145例服用拉米夫定的乙肝患者发生HBV rtM204I／V位点突变与HBV数量和用药时间的关系，为乙肝患者临床个体化治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 检测对象

选择2008年6月～2011年8月来自武汉普仁医院、武汉市江夏区人民医院等医疗机构就诊的145例乙肝患者（符合中华医学会慢性乙型病毒性肝炎临床诊断标准［2］），并排除其它病毒如丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、甲型肝炎病毒（HAV）、戊型肝炎病毒（HEV）和艾滋病毒（HIV）等导致的肝脏损害者；用药初期rtM204I／V检测阴性。

145例患者中男76例，女69例，平均年龄35.80±12.50岁。所有患者均连续接受葛兰素史克制药（苏州）有限公司生产的贺普丁（拉米夫定）薄衣片（国 药 准 字 H20030581，0.1g／片 ）治 疗，口 服100mg，每日1次，治疗时间6～24个月。后文两种分组中各组年龄、性别、肝功能情况等差异均无统计学意义，具有可比性。

1.2 实时荧光定量PCR检测HBV数量

采用真空促凝管采集患者治疗结束后空腹静脉血，离心后分离血清送检。采用美国ABI 7300荧光定量PCR分析仪检测HBV DNA数量，试剂盒来自艾康生物技术（杭州）有限公司，批号分别为国药准字S20060017和国食药监械（准）字2011第3401263号，最低检测下限500IU／ml。具体反应体系的建立以及实验步骤严格按照试剂盒和仪器说明书进行。

1.3 DNA测序

采用直接测序法。以荧光定量PCR检测时提取的HBV DNA为模板，采用巢式PCR扩增HBV P区基因，两对引物分别为：F1：5’-CTG CTC AAG GAA CCT CTA TG-3’，R1：5’-AGG TGA AGC GAA GTG CAC-3’；F2：5’-CAT CCT GCT GCT ATG CCT C-3’，R2：5’-GTT CAA ATG TAT ACC CAA AG-3’。PCR体系为50μl，含10×buffer（Mg2+plus）5μl，dNTP 0.2μM，上、下游引物各10pmol，高保真 Taq酶（日本 ToYoBo公司）1.25U，DNA模板2μl。PCR扩增条件为：94℃预变性2min；94℃ 30s，55℃25s，72℃ 40s，共35个循环；最后72℃延伸2min。对以上PCR产物进行电泳确认后，送上海英俊生物技术有限公司测序。

1.4 统计学处理

采用SPSS 15.0统计学软件。计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HBV DNA数量与YMDD变异病毒

将 HBV DNA数量以105IU／ml为界线［3］，分为 HBV DNA≥105IU／ml组（B组，68例）和＜105IU／ml组（A组，77例）。分别对两组YMDD rtM204I／V进行分析和比较，具体结果如表1：组间比较，B组的YMDD纯合突变率高于A组，但其杂合突变率低于A组；组内比较，B组的纯合突变率高于杂合突变率，A组的纯合突变率低于杂合突变率，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 不同HBV DNA数量与YMDD突变率（n，%）

2.2 HBV YMDD突变率与治疗时间

根据测序结果将145例患者分为未变异组（YMDD）、纯 合 变 异 组 （YVDD、YIDD、YVDD／YIDD）和 杂 合 共 生 组 （YMDD／YIDD、YMDD／YVDD、YMDD／YVDD／YIDD），分析各组变异率和药物治疗时间。结果显示，145例乙肝患者中，未发生变异者66例（45.52%），平均治疗时间为252天；出现纯合变异者46例（31.72%），平均治疗时间为383天；出现杂合共生者33例（22.76%），平均治疗时间为488天。统计分析表明，纯合变异组突变率高于杂合共生组，但其拉米夫定治疗时间短于杂合共生组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 HBV YMDD变异与药物治疗时间

3 讨 论

慢性乙肝患者的治疗是一个长期的过程，目前临床上以核苷类药物为主的抗病毒治疗被普遍采用，随之而来的是由药物引起的病毒变异以及耐药现象的出现。并且由于不同的病毒变异株对于相关药物的反应效果以及采用的具体治疗方案之间有着很大的差异，所以在明确患者体内的病毒数量以及相关免疫指标的同时，在临床治疗，特别是初诊中还需要明确患者体内的病毒变异以及杂合共生状态。

本文分析结果表明，乙肝患者HBV DNA≥105IU／ml组纯合突变者比例显著高于HBV DNA＜105IU／ml组。提示HBV数量较低时，乙肝患者体内可能处于多种病毒株杂合状态，特别是那些长期治疗而迁延不愈的病人，需优先考虑联合用药，以便对不同基因型毒株进行抑制［4］。而对病毒数量较高的病人，由于其体内病毒株可能比较单一，此时应尽量采用单一药物治疗。对于HBV纯合突变与杂合共生状态的关系，推测可能是体内不同病毒株相互抑制，导致每个单一毒株复制较慢，而使体内总病毒数量不高；但当其中某一个毒株在内外环境压力下开始大量复制，其它毒株被完全抑制时，体内病毒株多为单一纯合状态［5］。但这种推测还需要大量实验予以证实。

本实验还证实HBV的变异与药物拉米夫定治疗的时间有关，治疗时间较长者，容易产生YMDD变异（包括纯合变异和杂合变异），这与Lai等［6］的观察结果一致。

HBV变异是一个长期的、由单一野生纯合状态向多个变异株杂合共生状态发展的过程。这种变异与目前临床耐药变化相吻合［7］。因此强调在对乙肝患者药物治疗时要注意控制总治疗时间，尽量在治疗早期取得效果，避免长期用药引起HBV变异而给临床治疗带来困难。

1 Mello FC，Lago BV，Lewis-Ximenez LL，et al.Detection of mixed populations of wild-type and YMDD hepatitis B variants by pyrosequencing in acutely and chronically infected patients［J］.BMC Microbiol，2012，12（1）：96～104.

2 贾继东，李兰娟.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）［J］.肝脏，2011，16（1）：2～16.

3 乙型肝炎病毒耐药专家委员会.乙型肝炎病毒耐药专家共识［J］.中华预防医学杂志，2009，43（9）：809～813.

4 Liu L，Tang YZ，Li JG，et al.Evolution of hepatitis B virus quasispecies during lamivudine-entecavir sequential therapy［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2010，18（6）：423～427.

5 Feng Liu，Li Chen，DM Yu，et al.Evolutionary patterns of hepatitis B virus quasispecies under different selective pressures：correlation with antiviral efficacy［J］.Gut，2011，60（9）：1 269～1 277.

6 Lai CL，Dienstag J，Schiff E，et al.Prevalence and clinical correlates of YMDD variants during lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B［J］.Clin Infect Dis，2003，36（6）：687～696.

7 Liang PP，Guo JJ，Li QL，et al.Evolution of hepatitis B virus quasispecies during antiviral therapy in one chronic hepatitis B patient［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2011，19（7）：516～520.