慢性阻塞性肺疾病患者外周血Rho激酶水平测定的临床意义

曾建红，曾 军

（1.广东省广州市第一人民医院鹤洞分院 510380；2.广东省广州市第一人民医院呼吸内科 510380）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一组慢性气道阻塞性疾病的统称，疾病发展后期的肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）常会导致肺源性心脏病（肺心病）的发生，大约80%～90%的肺心病是由COPD疾病发展而来[1]。目前，COPD的人群发病率约为1.7%，因此，延缓慢性炎症所导致的PAH的形成，是COPD疾病终末阶段肺心病防治的一个有效途径[2－3]。Rho激酶（Rho associated coiled coil forming protein kinase，ROCK），又称Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶，是小G蛋白Rho的下游效应激酶。有研究显示Rho激酶的活化与血管平滑肌的增生和血管的重构有着密切的关系，参与了动脉粥样硬化、高血压、肺心病等多种疾病的发生发展过程[4－5]。现将本研究COPD合并PAH患者血清以及单核细胞ROCK水平的临床意义报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年1月至2011年1月本院收治的COPD患者40例，根据病情分为两组，COPD伴PAH患者20例为A组，男14例，女6例；年龄45～76岁，平均（57.2±14.3）岁。不伴PAH的COPD患者20例为B组，男12例，女8例；年龄42～75岁，平均（54.8±12.7）岁；选取本院同期体检中心健康体检者20例为对照组，男13例，女7例；年龄41～74岁，平均（54.2±11.8）岁。所有受试者均签署知情同意书并获得本院伦理委员会批准。3组患者在性别、年龄、体质量等方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 入选和排除标准 参照1997年全国第2次肺心病专业会议制定的标准，患者吸入支气管舒张药后第1秒用力呼气容积／用力呼气肺活量（FEV1／FVC）＜70%及FEV1＜80%定义为COPD；参照2009年欧洲心脏病学会PAH诊断指南，将肺动脉平均压大于或等于25 mm Hg，伴有气促、下肢水肿等临床表现定义为PAH。排除标准：有心血管疾病，支气管扩张，肝、肾等脏器疾病，近期使用过他汀类药物者。

1.3 肺动脉平均压测定 肺动脉平均压＝0.61×[4×（三尖瓣反流速度）＋右房压]＋2。

1.4 血清Rho激酶1（ROCK1）水平的测定 采集所有受试者过夜空腹12 h静脉血，3 000 r／min，离心15 min，分离上清液。ROCK1检测ELISA试剂盒购自美国D＆G公司，严格按着试剂盒说明书操作，酶标仪450 nm波长处测定各孔的光密度值（optical density，OD）。以标准品浓度为横坐标，所对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，然后对照标准曲线根据血清样品的OD值计算ROCK1的表达水平。

1.5 单核细胞ROCK1表达水平的流式细胞仪检测 采集所有受试者过夜空腹12 h静脉血20 mL，参照黄芬等[6]的方法分离单核细胞，血液中加入PBS缓冲液和淋巴细胞分离液，1 000×g，离心10 min，细胞分层，吸取所需的单核细胞，PBS缓冲液洗涤细胞2次，500μL PBS重悬细胞，按照抗体说明书加入10μL FITC－ROCK1或者同型对照（美国R＆D公司）室温孵育30 min，流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）IL1通道检测10 000个单核细胞，计算ROCK1的表达水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS12.0软件进行统计学处理，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验和单因素方差分析，Pearson相关性分析检测各指标的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

3组受试者血清ROCK1水平、外周血单核细胞ROCK1水平及肺动脉平均压变化见表1，3组受试者外周血单核细胞ROCK1水平的流式细胞仪检测见图1。Pearson相关性分析显示：受试者血清ROCK1水平与肺动脉平均压呈正相关（r＝0.654，P＜0.05），外周血单核细胞ROCK1水平与肺动脉平均压亦呈正相关（r＝0.664，P＜0.05），血清ROCK1水平与外周血单核细胞ROCK1水平呈正相关（r＝0.864，P＜0.01）。

表1 3组受试者血清者ROCK1水平、外周血单核细胞ROCK1水平及肺动脉平均压变化（±s，n＝20）

表1 3组受试者血清者ROCK1水平、外周血单核细胞ROCK1水平及肺动脉平均压变化（±s，n＝20）

＊：P＜0.05，与对照组比较；▲：P＜0.05，与B组比较。

组别 肺动脉平均压（mm Hg）血清ROCK1表达水平（pmol／L）单核细胞ROCK1表达水平（%）A组 51.37±11.64＊▲36.72±7.18＊▲31.21±8.83＊▲B组 25.14±4.28＊23.55±4.97＊10.56±3.72＊对照组20.14±3.45 13.10±2.67 3.61±2.44

图1 3组患者单核细胞ROCK1表达的流式细胞仪检测

3 讨 论

COPD在老年人群中患病人数多，疾病会反复发作，最终会导致PAH的产生，严重影响了患者的生活质量[7]。ROCK分为N末端催化结构域、卷曲螺旋结构域、C端PH结构域3部分，N末端具有丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶活性，可以磷酸化下游的靶蛋白产生一系列的生物学效应。Rho激酶有ROCKl和ROCK2 2个亚基，ROCKl和ROCK2氨基酸序列有65%的同源性，丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶催化活性区同源性高达92%，两个亚基有一定的组织分布特异性，研究显示ROCKl对血管平滑肌细胞的促增殖作用较明显[8－10]。本研究显示，血清和单核细胞中ROCK1的表达水平在对照组、A组和B组3组之间比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），说明Rho激酶的高表达参与了COPD患者PAH的形成和发展。

ROCK信号通路可以通过多种方式参与PAH的形成，例如ROCK通过Erk信号通路抑制骨形态发生蛋白所引起的p－Smad1核迁移，促进肺动脉平滑肌细胞增殖；诱导活性氧产生损伤血管平滑肌收缩性并诱发血管结构重构，另外血小板源性生长因子、5－羟色氨、血管紧张素Ⅱ等血管活性物质也主要是通过ROCK信号通路来促进血管平滑肌细胞的增生和肥大[10－11]。本研究显示，血清和单核细胞ROCK1的表达水平与肺动脉平均压呈正相关，证明了ROCK在PAH中的作用，提示ROCK可以成为降低肺动脉压的一个新的治疗靶点。有研究显示，ROCK的抑制剂法舒地尔可以显著降低肺动脉压力，而且在吸氧气或口服钙离子通道阻滞剂等常规治疗无效的患者，法舒地尔也可以起到降低肺动脉压力的作用[12－13]。COPD病理基础就是小气道的慢性炎症，慢性炎症必然会有间质慢性炎性细胞浸润，本研究COPD患者外周血单核细胞ROCK表达升高，在伴发PAH患者中显著升高，说明了单核细胞参与了COPD疾病PAH的形成和发展，相关性分析血清ROCK1水平与外周血单核细胞ROCK1表达水平呈显著正相关（r＝0.864，P＜0.01），说明血液中的ROCK可能主要是慢性炎症刺激单核细胞所分泌。

综上所述，ROCK信号通路的激活参与了COPD疾病PAH的形成和发展，ROCK是降低PAH的一个潜在治疗靶点。

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