利用秀丽隐杆线虫初步评价药物急性毒性

周雨朦，朱春宝，陈代杰，李继安

(中国医药工业研究总院上海医药工业研究院，上海 200040)

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C.elegans)是一种经典的模式生物，因其结构简单、通体透明、繁殖快、生命周期短和易于实验室培养，被广泛用于生命科学等领域。近年来，C.elegans又被用于药物筛选研究和环境毒性检测与生态毒理学研究。目前，已经建立了 C.elegans高通量药物筛选模型［1－3］和基于C.elegans的不同种类化合物筛选方法(如抗感染药物［4－6］、小分子钙离子通道拮抗剂［7］和抗衰老药物［1］。在环境毒性检测中，已初步建立了 C.elegans液态环境研究方法［8－9］;利用C.elegans检测环境中化学试剂、重金属离子等毒性［10－11］。但是，利用 C.elegans对各类药物进行毒性评估，还没有相关的研究报道。因此，本研究采用C.elegans对4大类抗感染抗生素，包括青霉素类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类和3种抗肿瘤药物进行毒性评估，统计经过待测药物处理若干时间后线虫的存活率。这种存活率不仅反映待测药物的综合质量，同时也反映了药物随时间在线虫体内的积累效应。通过了解不同种类药物对线虫的毒性，掌握化合物毒性范围，为进一步哺乳动物毒性实验提供依据。初步建立非哺乳动物——C.elegans药物急性毒性评价体系。

1 材料与方法

1.1 药物和仪器

青霉素(penicillin)、苯唑西林钠(oxacillin sodium)、氨苄西林(ampicillin)、红霉素(erythromycin)、阿奇霉素(azithromycin)、盐酸四环素(tetracycline hydrochloride)、盐酸金霉素(chlortetracycline hydrochloride)、土霉素 (oxytetracycline)、链霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramycin)、卡那霉素(kanamycin)、硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate)、硫酸西索米星(sisomicin sulfate)、阿米卡星(amikacin)和丝裂霉素C(mitomycin C)由本实验室保藏，纯度在99%以上。柔红霉素(daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin)购自Pharmacia＆Upjohn公司。NV-T型体视显微镜(配视频摄像器)为上海精密仪器仪表有限公司产品。

1.2 秀丽隐杆线虫的培养

C.elegans WT Bristol N2［12］由复旦大学附属华山医院中西医结合研究所惠赠，glp-4(bn2ts);sek-1(km4)［6］由哈佛大学医学院遗传学部提供，均饲养于涂布E.coli OP50的标准线虫培养基(NGM)［13］中。E.coli OP50采用 Luria-Bertani培养基(LB培养基)进行培养。

1.3 药物毒性的测定

将处于产卵阶段的线虫进行同期化处理［17］，从平板上收集孕虫，清洗，最后剩约500μl虫悬液，之后加入400μl漂白剂(5%NaClO)和100μl NaOH 5 mol·L－1，漩涡振荡3～4 min至虫体大部分溶解，然后加入无菌水稀释，1300×g离心1 min，弃上层液体，再清洗1次，收集同步化生长的虫卵。将虫卵置于M9缓冲液［14］中15℃过夜孵育至 L1期。之后，将L1期线虫转接到覆有E.coli OP50的NGM培养基上，25℃培养48～52 h到L4期(不孕阶段)，用M9缓冲液将其从平板上洗下，重悬，清洗，收集虫体进行药物急性毒性实验。本实验全部采用处于幼虫发育后期L4期的线虫进行毒性考察实验。

配制不同浓度梯度的待检测药物溶液(表1)。将100μl配制好的待测药物溶液加入无菌的96孔板中，然后再转入100μl含20条的线虫溶液，最终毒性考察体系为200μl。每个药物浓度梯度做3个复孔，以不含药物的线虫溶液体系作为空白对照。在染毒后第1天，统计线虫存活率，之后每隔1 d，观察线虫的存活情况，直到第7天。线虫身体僵直，用探针触碰没有反应，判定为死亡。

Tab.1 Preparation of drugs

1.4 统计学分析

实验均重复3次，线虫生存统计数据使用GraphPad Prism 5.01软件。采用Kaplan-Meier方法进行生存分析，log-rank检验法对组间的数据进行差异显著性分析。毒性实验结果采用Origin Pro 8.0软件处理分析，利用DoseResp函数进行拟合，并计算药物半致死剂量(LC50)，并且采用t检验法进行组间差异显著性分析。

2 结果

2.1 不同品系线虫对药物毒性的敏感度

实验考察野生型N2和突变型glp-4;sek-1线虫分别在含红霉素250 mg·L－1、四环素或是多柔比星50 mg·L－1染毒体系中，7 d内的存活情况。如图1所示，在相同毒性体系中，glp-4;sek-1线虫的死亡速率要大于N2线虫的死亡速率。在红霉素250 mg·L－1染毒体系中，N2线虫的半数死亡天数为5 d，glp-4;sek-1线虫的半数死亡天数为3 d(P＜0.01);在四环素 250 mg·L－1染毒体系中，N2 线虫的半数死亡天数为7 d、glp-4;sek-1线虫的半数死亡天数为 5 d(四环素 P＜0.01);在多柔比星50 mg·L－1染毒体系中，N2线虫的半数死亡天数＞7 d、glp-4;sek-1线虫的半数死亡天数为 3 d(P＜0.01)。结果表明两种品系的线虫对药物毒性的敏感度具有显著性差异，glp-4;sek-1与N2线虫相比药物的毒性更敏感。

Fig.1 Effect of EM，TC and Dox on N2 and glp-4;sek-1 survival rate.EM 250 mg·L －1;TC 250 mg·L －1;Dox 50 mg·L －1.

2.2 大环内酯类药物毒性

考察红霉素和阿奇霉素对线虫的急性毒性，选取染毒72 h后的数据进行函数拟合(图2)，相关系数R2均在0.99左右，表明存在典型的剂量-效应关系。红霉素对N2和glp-4;sek-1线虫的72 h半致死剂量〔LC50(72 h)〕分别 为 250 mg·L－1和120 mg·L－1;而阿奇霉素分别为 411 mg·L－1和286 mg·L－1。以上数据可以看出:① 在 N2和glp-4;sek-1线虫评估体系中，红霉素的毒性均要大于阿奇霉素毒性(P＜0.05)。此结果与小鼠急性毒性实验结果相一致(表2)。②glp-4;sek-1与N2线虫相比对红霉素和阿奇霉素的药物毒性更敏感。目前，glp-4;sek-1线虫已用于抗细菌和真菌感染药物的高通量筛选［2－3］。作为常用的药物筛选模型，并且具有对药物毒性敏感度强的特性，因此，后续研究均采用glp-4;sek-1线虫考察药物毒性。

Tab.2 Toxic index of testing drugs

Fig.2 Effect of EM and AZM on N2 and glp-4;Sek-1 survival rate.Data was fitted with DoseResp.

2.3 四环素类药物的毒性

采用上述方法进行数据分析和拟合(R2均在0.99左右)，四环素、土霉素和金霉素的LC50(72 h)分别为316，383和359 mg·L－1(图3)。在线虫评估体系中，四环素、土霉素和金霉素的药物毒性相当，与资料显示(表2)的小鼠口服急性毒性实验结果相一致。

Fig.3 Concentration-response curve for the toxicity of TC，OTC and CTC.Data were fitted with DoseResp.

2.4 氨基糖苷类药物的毒性

对6种氨基糖苷类药物进行线虫毒性考察，记录染毒72 h后线虫存活数据，对数据进行分析拟合(图4)。6种药物对线虫的毒性大小为:妥布霉素＞庆大霉素＞西索米星＞链霉素＞卡那霉素＞阿米卡星;大致分为3个等级:阿米卡星和卡那霉素LC50(72 h)＞2000 mg·L－1;链霉素、西索米星和庆大霉素LC50(72 h)在 1000 mg·L－1左右;妥布霉素LC50(72 h)＜500 mg·L－1。与资料报道的氨基糖苷类药物毒性作比较，发现在小鼠po和sc给药急性毒性实验中，妥布霉素毒性(LD50分别为10 500和441 mg·kg－1)相对西索米星毒性(LD50分别为5000和288 mg·kg－1)较小，而在线虫体系中，妥布霉素的LC50(72 h)460 mg·L－1要大于西索米星的LC50(72 h)804 mg·L－1。表明某些药物对线虫的毒性相对较强，而对小鼠的毒性相对较弱，而对于具体的机制还有待进一步研究。但是总体上，线虫评价的药物毒性大小基本与小鼠相似(图5)。

Fig.4 Effect of AMK，Kan，SM，Siso，GM and Tob on glp-4;sek-1 survival rate.Data was fitted with DoseResp.AMK:amikacin;Kan:kanamycin;SM:streptomycin;Siso:sisomicin sulfate;GM:gentamicin sulfate;Tob:tobramycin.

Fig.5 Trend curve of aminoglycoside antibiotic toxicity on mice and glp-4;sek-1.

2.5 青霉素类药物的毒性

实验考察青霉素、氨苄西林和苯唑西林在62.5 ～2000 mg·L－1浓度范围内对线虫的毒性。实验采集了第5天的线虫存活数据，发现当药物浓度达到2000 mg·L－1时，所有染毒体系中线虫的存活率仍在95%以上(图6)。根据化合物毒性分级标准判定，3种药物对线虫几乎没有毒性，属于低毒性化合物。

Fig.6 Effect of PV，Amp and OXSon glp-4;sek-1 survival rate.

2.6 抗肿瘤类药物的毒性

考察3种抗肿瘤类药物对线虫毒性分别为:柔红霉素 LC50(72 h)为 45.5 mg·L－1;多柔比星 LC50(72 h)为55.8 mg·L－1;丝裂霉素 C LC50(72 h)为43.8 mg·L－1。柔红霉素、多柔比星和丝裂霉素 C对线虫的毒性没有显著性差异(图7)。与资料报道的小鼠评价体系相比，线虫体系对这3种抗肿瘤药物没有很高的毒性区分度，并且丝裂霉素C对线虫毒性和小鼠(LD50=23 mg·kg－1)相差不大。这3种抗肿瘤药物的机制是抑制DNA生物合成，推测3种药物对线虫造成的毒性是一致的，因此，在线虫评价体系中无法得到区分。

Fig.7 Effect of NDR，Dox and MMC on glp-4;sek-1 survival rate.Data was fitted with DoseResp.

3 讨论

秀丽隐杆线虫已被广泛用于各类药物筛选中，作为一个整体生物筛选模型对药物的有效性进行评价。但是在对药物进行有效性评价的同时，是否可以对其安全性进行初步评价。因此，本实验采用线虫在环境毒理学中研究的方法，对4大类抗生素和3种抗肿瘤药物进行急性毒性评价，通过线虫存活率，来反映药物的急性毒性。大部分药物在线虫评价体系中呈现的毒性大小，与小鼠评价体系相类似。然而，线虫作为黑箱式的评价系统，与哺乳动物相比存在一些不足之处，包括线虫没有心脏，呼吸系统，眼、耳和肾等器官，所以无法对药物的具体毒性、损伤器官等进行评价，可能造成对某些药物毒性相对敏感或相对不敏感的差异。鉴于线虫与人类种间距离太远，线虫的作用仍处在药物研发和评价初期，为化合物快速粗筛和毒性评价提供线索。

总之，秀丽隐杆线虫是一个很好的药物毒性检测器，通过监测线虫的死亡率来反映药物急性毒性大小，对药物的安全性进行初步评价。与小鼠评价模型相比，此评价系统操作简单，监测方便，周期短，投入少，更适合化合物高通量筛选和毒性预评估。

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