固态发酵法脱除菜籽饼粕中总酚及芥子碱的工艺研究

周浩宇，黄凤洪，钮琰星，黄 茜

（1.河南科技学院食品学院，河南新乡453003；2.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉430062）

固态发酵法脱除菜籽饼粕中总酚及芥子碱的工艺研究

周浩宇1，2，黄凤洪2，*，钮琰星2，黄 茜2

（1.河南科技学院食品学院，河南新乡453003；2.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉430062）

筛选出能高效降解菜粕中总酚及芥子碱的菌株，并进行混合发酵，研究了不同菌株、不同菜粕原料、不同接种量、不同发酵时间、不同营养源及不同金属离子对总酚及芥子碱降解率的影响。结果表明：酿酒酵母、纳豆芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌B4以8%的总接种量，等比例接种到添加了5%糖蜜和0.05%的硫酸铜及硫酸亚铁的菜籽饼粕（含水量为50%）中，发酵72h，菜粕中的总酚和芥子碱降解率可达到70.72%及80.06%。

总酚，芥子碱，菜籽饼粕，混合发酵

菜粕是数量上仅次于豆粕的植物蛋白源，我国年产量约有700万t。随着菜籽双低（低硫甙、低芥酸）化进程的推进，酚类物质成为菜粕中重要抗营养因子之一。菜籽中的多酚类化合物通常以游离酸、酯类及不溶性化合物的形式存在，主要分为简单酚类和多酚类物质。菜粕中的简单酚类主要以芥子碱为主，多酚以单宁为主。芥子碱在中性和碱性条件下易发生氧化和聚合作用，是使菜籽粕变黑并产生不良气味及苦味的主要原因，亦能使褐壳鸡蛋产生鱼腥味[1-3]。多酚类化合物及其氧化物能与蛋白质、必需氨基酸、酶和其他物质形成络合物，都能与蛋白质结合，影响菜籽蛋白在动物体内的消化吸收。菜籽多酚还能螯合金属离子，影响动物对金属离子的吸收利用[4]。目前由于难以通过遗传育种减少其在菜籽粕中的含量[5]，因此在用油菜、芥菜等其他十字花科植物饲喂家畜时应做处理或限制用量在5%以内[6]。对菜粕多酚和芥子碱的脱除方法进行研究，不仅能解决菜粕饲料适口性差的问题，而且为菜粕的精深加工与利用提供基础依据。微生物法具有条件温和、干物质损失小等优点，且脱毒效果好，能提高菜籽粕中蛋白质的含量和质量，从而改善菜粕的饲料效价[7]。本文从研究室保藏的对菜粕有降解作用的菌株中筛选出对多酚芥子碱降解率高的菌株，研究混合发酵在不同接种量、不同发酵时间、不同营养添加剂及不同芥子碱降解剂的工艺条件下对芥子碱降解的影响，从而为菜籽饼粕生物改良技术的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌株 研究室预先筛选并保藏的菌株（16株）；菜籽饼粕 国产普通菜籽预榨浸出粕，冷榨脱皮菜粕；YPD培养基 酵母膏1.0g，蛋白胨2.0g，麦芽浸粉1.0g，葡萄糖2.0g，蒸馏水100mL；豆芽汁蔗糖培养基 黄豆芽20.0g，葡萄糖2.0g，水100mL，pH7.2；牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏1.0g，蛋白胨1.0g，葡萄糖2.0g，NaCl 0.5g，水100mL，pH7.0～7.2；菜籽饼粕固态发酵培养基 菜籽饼粕（30目）50g，自来水50mL（含水量50%），115℃灭菌15min。

1.2 实验方法

1.2.1 不同菌株对总酚及芥子碱降解率的影响 将保藏的各菌株，从斜面转接到摇瓶种子液中培养24h，再将种子液以5%的接种量接入到菜籽饼粕固态发酵基上，30℃下静置培养72h，发酵完毕后60℃烘干。1.2.2 不同菜粕原料总酚及芥子碱降解率的影响 将选定的降解率较高的菌株分别从斜面转接到摇瓶种子液中培养24h，再将种子液以5%的总接种量等比例接入到不同原料的菜籽饼粕固态发酵基上，30℃下静置培养72h，发酵完毕后60℃烘干。

1.2.3 不同接种量对总酚及芥子碱降解率的影响 将菌株分别从斜面转接到摇瓶种子液中培养24h，再将种子液以1%、3%、5%、8%、10%的总接种量等比例接入到脱皮菜籽饼粕固态发酵基上，30℃下静置培养72h，发酵完毕后60℃烘干。

1.2.4 发酵时间对总酚及芥子碱降解率的影响 将菌株分别从斜面转接到摇瓶种子液中培养24h，再将种子液以8%的总接种量，等比例接入到菜籽饼粕固态发酵基上，30℃下静置，分别发酵培养24、36、48、60、72、84、96h，发酵完毕后60℃烘干。

1.2.5 不同营养源对总酚及芥子碱降解率的影响 在菜粕中分别添加几种不同的营养源各5%，将菌株分别从斜面转接到摇瓶种子液中培养24h，再将种子液以8%的总接种量等比例接入到脱皮菜籽饼粕固态发酵基上，30℃下静置培养72h，发酵完毕后60℃烘干。1.2.6 不同金属离子对总酚及芥子碱降解率的影响 在菜粕中分别添加CuSO4、ZnSO4、FeSO4、CaCl2各0.05%，将菌株分别从斜面转接到摇瓶种子液中培养24h，再将种子液以8%的总接种量等比例接入到添加了糖蜜的脱皮菜籽饼粕固态发酵基上，30℃下静置培养72h，发酵完毕后60℃烘干。

1.2.7 总酚芥子碱测定方法 总酚检测以单宁酸为标准品，芥子碱的检测按照BLAIR[8]的方法进行。

总酚及芥子碱降解率：（原含量-降解后含量）/原含量

2 结果与分析

2.1 不同菌株对总酚及芥子碱降解率的影响

由图1可以看出，不同菌株对总酚及芥子碱的降解效果由高到低依次为酵母类、细菌类、霉菌类。这可能是因为酵母类菌株高产能降解总酚及芥子碱的酶系，如多酚氧化酶、β-葡萄糖苷酶等。酵母类中酿酒酵母的降解效果最优，其芥子碱降解率达55.41%，总酚降解率达69.66%。细菌中纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌B4脱除芥子碱效果也较为明显，芥子碱降解率达50%左右，总酚降解率在60%左右。霉菌中变色栓菌的脱除效果远优于其他几株霉菌，这是因为变色栓菌能产漆酶，可高效降解芥子碱。本研究室一直从事菜粕中抗营养因子（芥子碱、单宁、硫甙、植酸等）的生物降解研究工作，在实验研究中发现酿酒酵母对菜粕中的总酚及芥子碱具有较好的脱除作用，提高菜粕中粗蛋白含量，且发酵后具有浓郁的酵香味，能改善菜籽饼粕的适口性，而纳豆芽孢杆菌除了能较好地降解芥子碱外，还能分解蛋白质为短肽，促进动物的消化吸收；而因此将酿酒酵母、纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌B4进行混合发酵实验，发酵后总酚及芥子碱降解率明显高于单菌。

图1 不同菌株对总酚及芥子碱降解率的影响Fig.1 The degradation of total phenolics and sinapine of different strains

2.2 不同菜粕原料总酚及芥子碱降解率的影响

表1 不同菜粕原料对发酵的影响Table 1 Effect of different rapeseed meals on fermentation

由表1可看出，普通菜粕及冷榨脱皮菜粕原料中的总酚及芥子碱含量差异不大，经过选定的混菌发酵后，冷榨脱皮菜粕中的总酚及芥子碱含量要远低于普通菜粕。这是由于脱皮后的菜粕粗纤维含量降低，蛋白质含量提高，营养物质更易被微生物生长利用，促进抗营养物质的降解转化。因此，选用脱皮冷榨菜粕进行实验研究。

2.3 不同接种量对总酚及芥子碱降解率的影响

图2 不同接种量对总酚及芥子碱降解率的影响Fig.2 The degradation of total phenolics and sinapine of different inoculation amount

由图2可知，随着接种量的增大，芥子碱含量逐渐减少，当三支菌株的总接种量达到8%时，总酚及芥子碱降解率分别为69.27%和78.19%。因为采用较大的接种量可以缩短菌体繁殖达到高峰的时间，使降解芥子碱的酶系提前形成；但是接种量过大会引起溶氧不足，影响酶的形成，且不经济。接种总量为8%和10%时，芥子碱降解率非常接近，综合考虑，接种量采用8%较为合适。

2.4 发酵时间对总酚及芥子碱降解率的影响

图3 发酵时间对总酚及芥子碱降解率的影响Fig.3 The degradation of total phenolics and sinapine of different fermentation time

图3结果显示，随着菜粕发酵时间的推移，总酚及芥子碱含量逐渐降低，发酵24～72h，芥子碱的降解效果明显。发酵72h时，总酚及芥子碱的降解率分别达到65.36%及62.18%，72h后，芥子碱的含量虽然也在减少，但是降解效果已趋于平缓。从实际生产考虑，选择72h较为合适。

2.5 添加不同营养源对总酚及芥子碱降解率的影响

图4 不同营养源对总酚及芥子碱降解率的影响Fig.4 The degradation of total phenolics and sinapine of different nutritional additives

由图4可看出，添加营养源后总酚及芥子碱的降解率比未添加有所提高，而不同营养源之间的降解效果也有差异，其中添加糖蜜后的效果最好。糖蜜含有少量粗蛋白及多种矿物质，更含有大量可发酵糖（主要是蔗糖），因而是很好的发酵原料。另外，添加营养源可促使菜粕中的其他抗营养成分，如硫甙、粗纤维的降解，还可以提高粗蛋白、多肽的含量。因此，在工厂大批量发酵时可适量添加营养源。

2.6 不同金属离子对总酚及芥子碱降解率的影响

由图5可看出，添加不同的金属离子对芥子碱降解率影响较为显著，硫酸铜、硫酸亚铁可促进芥子碱的降解，氯化钙对芥子碱降解有抑制作用；添加硫酸锌则无影响。其中硫酸铜对芥子碱的降解效果最为明显，降解率可达70.72%，这可能是由于铜离子能够刺激多酚氧化酶等酶系的产生，而芥子碱在多酚氧化酶的酶解作用下更快分解。另外，DAS等[9]人利用不同的金属盐溶液（CuSO4、FeSO4、NiSO4及ZnSO2）对菜粕进行浸泡处理，并在肉鸡和猪的日粮中按体重添加80～160g/kg用CuSO4溶液处理过的菜籽饼粕，发现其对生长、甲状腺功能、碘的吸收、血浆中Zn含量及碱性磷酸酶活性都有很好的改善作用。因此，在饼粕中添加适量的金属离子对发酵及动物饲养效果良好。

图5 不同金属离子对总酚及芥子碱降解率的影响Fig.5 The degradation of total phenolics and sinapine of different metal ions

3 结论

3.1 本实验研究了不同菌株、不同菜粕原料、不同发酵工艺及不同添加剂对菜粕总酚及芥子碱降解率的影响，发现在菜粕中添加一定比例营养源及硫酸铜、硫酸亚铁，采用酿酒酵母、枯草芽孢杆菌B4和纳豆芽孢杆菌混合发酵，在总接种量为8%，含水量为50%，固态发酵72h时，菜粕中的总酚、芥子碱降解率可达到70.72%及80.06%。

3.2 目前，本研究室已筛选出高效降解芥子碱的菌株-酿酒酵母，并对其降解途径和机理进行了初步的探索，研究菌株发酵降解芥子碱的主要酶系，为微生物降解脱除菜粕中的抗营养因子提供理论基础。

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Study on desorption condition of total phenolics and sinapine in rapeseed meal by solid fermentation

ZHOU Hao-yu1，2，HUANG Feng-hong2，*，NIU Yan-xing2，HUANG Qian2
（1.Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China；2.Oil Crops Research Chinese Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430062，China）

The strains which had high efficient degradation of total phenolics and sinapine were screened out，and then the mixed fermentation carried on.The influence of different strains，different inoculation quantity，different meal raw materials，different fermentation time，different nutritional additives and different metal ions of sinapine on the total phenolics and sinapine degradation rate were studied.The results indicated that Saccharomyces cerevisiae，Bacillus natto and Bacillus subtilis B4were inoculated to the rapeseed meal culture to get the best conditions of fermentation：the total inoculation amount was 8%，the water content was 50%，the fermentation time was 72h，the nutritional additives was 5%，the metal ions was 0.05%and then rapeseed meal was expanded before fermentation.The degradation rate of total phenolics and sinapine in rapeseed meal were 70.72%and 80.06%.

total phenolics；sinapine；rapeseed meal；mixed fermentation

TS201.3

A

1002-0306（2012）01-0183-03

2010－11－25 *通讯联系人

周浩宇（1985-），女，硕士，主要从事菜粕主要抗营养因子的生物降解机理研究。

2010国家自然科学基金（C200303）。