响应面法优化鼠李糖乳杆菌冻干保护剂配方的研究

许 娜，刘青梅，杨性民

（1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.浙江万里学院宁波市农产品加工技术重点实验室，浙江宁波315100）

响应面法优化鼠李糖乳杆菌冻干保护剂配方的研究

许 娜1，2，刘青梅2，*，杨性民2

（1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.浙江万里学院宁波市农产品加工技术重点实验室，浙江宁波315100）

直投式乳酸菌发酵剂的制备中，菌体在冷冻干燥过程中受损会降低发酵活力。采用响应面法结合Plackett-Burman实验设计与最陡爬坡法，探讨保护剂对鼠李糖乳杆菌的保护效果。结果表明：脱脂乳、海藻糖和甘油对菌体存活率的影响比较显著，脱脂乳与海藻糖、海藻糖与甘油对菌体存活率的交互作用影响高度显著，而脱脂乳与甘油的交互作用不显著。冻干保护剂最佳配方为：脱脂乳浓度6.56g/100mL、海藻糖浓度2.35g/100mL、甘油浓度2.47g/100mL，在此条件下，菌体存活率可达86.69%，该配方有较强的实用价值。

鼠李糖乳杆菌，响应面法，冻干保护剂，菌体存活率，最优配方

鼠李糖乳杆菌是重要的发酵食品工业生产用菌，特别是在发酵酸菜等制品的加工过程中发挥着重要作用。直投式发酵剂是一种不需经过活化和扩增便能直接应用于生产的发酵剂，具有保藏周期长、活菌含量高和质量稳定性高等优点[1]，能够显著提高发酵食品工业的生产效率和产品质量[2]。乳酸菌发酵剂的制备通常采用真空冷冻干燥技术，在冷冻干燥过程中，必然会使部分菌体细胞受损伤、死亡及某些蛋白酶分子钝化[3]，使发酵活力下降。冻干保护剂的添加可以有效地减少乳酸菌在冷冻干燥过程中造成的伤害，在直投式发酵剂制备的生产技术和经济上起着核心的重要作用[4-5]。本研究根据前人经验，选取8种公认的保护效果较好的冻干保护剂[6-8]作为实验对象，结合Plackett-Burman实验设计与最陡爬坡法，首先确定影响显著因素和最大响应值的响应区域，然后建立数学模型寻找最优组合，对保护剂配方进行筛选和优化，目标是最大限度地提高菌体存活率，期望得出鼠李糖乳杆菌开发成为直投式商品发酵剂的最优配方。

表1 Plackett-Burman实验设计及结果Table 1 Plackett-Burman experimental design and corresponding response of cell survival rate

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus） 中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC6001；MRS肉汤培养基（用于菌种的传代、扩培和种子液制备）、MRS琼脂培养基（用于菌落计数） 北京奥博星生物技术有限责任公司；脱脂乳粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司；谷氨酸钠、海藻糖、山梨醇、甘露醇、甘油、VC、硫酸锰 国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

YXQ-75SII立式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司；QT-2旋涡混合器 上海琪特分析仪器有限公司；SIGMA 6-16K型高速冷冻离心机、ALPHA 1-2型真空冷冻干燥仪 北京五洲东方科技发展有限公司；Formascientific-725超低温冰箱 美国Forma scientific公司；RZX智能型恒温培养箱 宁波江南仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 活菌体的富集与培养 将保藏的菌种经活化（10%脱脂乳粉）、传代与扩培，制成种子液，将制备的种子液接种于MRS肉汤培养基中制备发酵液，接种量均为5%。采用摇瓶培养，37℃、120r/min，添加0.5%K2HPO4作为缓冲液，调整pH在5.2左右，培养18h。1.2.2 菌悬液的制备 将发酵液移入已灭菌的离心管中，高速冷冻离心4000r/min，4℃，20min，弃上清液，用无菌水洗涤菌体，再以同样的条件离心，收集菌体并用无菌水调菌浓度至1010cfu/mL。

1.2.3 冻干保护剂的制备 依照实验设计，称取相应克数的保护剂，紫外杀菌30min，溶解于10mL无菌水中备用。

1.2.4 真空冷冻干燥条件 无菌条件下将保护剂与菌悬液混匀，-40℃冰箱中预冻2h，迅速转移至真空冷冻干燥仪，-60℃，0.011mbar，干燥24h。

1.2.5 活菌体存活率计算 取冻干菌粉，加入与冻干前菌悬液同等体积的10%脱脂乳，复水活化30min，根据GB4789.2-2010，采用梯度稀释平板活菌计数法，置于37℃恒温培养箱中培养48～72h。

1.2.6 冻干保护剂优化实验设计 以真空冷冻干燥后菌体存活率为响应目标：首先利用Plackett-Burman设计法在众多因素中筛选出具显著影响作用的几种因素；然后通过最陡爬坡实验，研究最大响应目标的响应区域；再利用Design Expert 7.0软件，采用Box-Behnken实验设计，进行响应面实验，最终确定最优实验数据，并进行结果验证。

2 结果与讨论

2.1 Plackett-Burman实验设计筛选显著影响因素

Plackett-Burman是一种基于不完整平衡块为原理的实验设计方法，它能够以较少实验次数准确而有效地筛选出最为重要的几个影响因素，供进一步详细的研究[9]。采用Minitab16.1软件进行实验设计和结果分析，选择次数为N=12的实验，针对8个因素进行研究，每种因素分别取-1、+1两个水平，响应值为冻干后菌体存活率。实验设计及结果见表1，各因素的效应评价见表2。

表2 Plackett-Burman实验设计各因素的效应评价Table 2 Estimated effects of Plackett-Burman design

由表1、表2可以看出，脱脂乳、海藻糖和甘油这3个因素对菌体存活率的影响比较显著，其中海藻糖影响最显著，其次是甘油与脱脂乳，其他因素影响均不显著。脱脂乳和海藻糖的t值为负，说明对响应值的影响具有显著性负效应，添加浓度应相应地减小；甘油的t值为正，说明对响应值的影响具有显著性正效应，添加浓度应相应地增加。

2.2 最陡爬坡实验研究最大响应值的响应区域

通过Plackett-Burman实验结果，筛选出了对菌体存活率具有显著性影响作用的三个因素，即脱脂乳、海藻糖和甘油，并且分析出了爬坡方向，便于实验确定各因素合理的水平，以逼近最大响应值的响应区域，进一步靠近最优点。最陡爬坡实验设计及结果见表3。

表3 最陡爬坡实验设计及结果Table 3 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

由表3可见，通过最陡爬坡实验确定了最大响应值的响应区域，实验设计以表3中4号实验为中心点，进行响应面实验设计。

2.3 Box-Behnken实验设计结果与响应面分析

2.3.1 实验设计及回归方程方差分析 以菌体存活率Y为响应值，采用Design-Expert7.0软件中的Box-Behnken设计进行实验设计，根据得出的实验结果建立二次响应面回归模型，以寻求最优实验数据。实验选用三因素三水平共15个实验点的响应面法实验，其中析因部分实验次数为12次，中心点重复实验次数为3次，用以估计实验误差。实验设计因素及水平见表4，优化设计方案及结果见表5。

表4 Box-Behnken设计因素及水平Table 4 Variables and levels in Box-Behnken design

表5 Box-Behnken优化设计方案及结果Table 5 Box-Behnken design and corresponding results

采用Design-Expert7.0软件对表5的实验数据进行响应面分析，编码值X1、X2、X3分别代表脱脂乳、海藻糖和甘油，回归方程的方差分析结果如表6所示。

表6 回归方程方差分析表Table 6 Analysis of variance for regression equation

由表6回归方程的方差分析可知，回归方程失拟项不显著（P=0.0645）且数值较小，说明数据拟合效果较好，实验误差小。对上述数据进行二次回归拟合，得到的二次回归拟合多项式方程为：

Y=86.37＋0.69X1＋3.63X2＋0.91X3＋1.80X1X2－0.12X1X3＋1.18X2X3－1.78X12－4.49X22－1.41X32。

相关系数R2=99.43%，P＜0.0001，说明方程拟合非常好，有实际的应用意义。回归方程模型的F检验极度显著，说明拟合的多项式方程非常合适，能够准确预测实际情况；一次项、二次项的F检验显著，说明所选择的脱脂乳、海藻糖和甘油三种因素对菌体存活率的影响都很显著，其中海藻糖极度显著，其次是甘油和脱脂乳；由交互项的F检验可知，脱脂乳与海藻糖、海藻糖与甘油对菌体存活率影响的交互作用高度显著，而脱脂乳与甘油的交互作用不显著。

图1 脱脂乳和海藻糖交互作用对菌体存活率影响的响应面图Fig.1 Response surface of interactive effects for skimmed milk and trehalose on cell survival rate

2.3.2 响应面图及等高线图分析 采用Design-Expert7.0软件设计得出的响应面图和等高线图，可以直观地反映各因素对响应值的影响，以及在反应过程中的交互作用影响。在等高线图中，椭圆型或者马鞍型的等高线表示因素之间交互作用显著，而圆型的等高线表示因素之间交互作用较弱。

由图1可以看出，等高线呈椭圆形，说明脱脂乳和海藻糖交互作用非常显著。当甘油浓度在2.6g/ 100mL，脱脂乳浓度范围在6.16～7.00g/100mL范围内，海藻糖浓度在2.34～2.70g/100mL范围内，可获得高于85.41%的菌体存活率。

图2 脱脂乳和甘油交互作用对菌体存活率影响的响应面图Fig.2 Response surface of interactive effects for skimmed milk and glycerol on cell survival rate

由图2可见，等高线呈圆型，说明脱脂乳与甘油交互作用不显著，当海藻糖浓度在2.40g/100mL时，脱脂乳浓度范围在6.25～6.95g/100mL，甘油浓度范围在2.51～2.80g/100mL，可获得高于85.72%的菌体存活率。

图3 海藻糖和甘油交互作用对菌体存活率影响的响应面图Fig.3 Response surface of interactive effects for trehalose and glycerol on cell survival rate

图3显示海藻糖和甘油交互作用显著，当脱脂乳浓度为6.5g/100mL，海藻糖浓度在2.34～2.7g/100mL范围内，甘油浓度在2.47～2.80g/100mL浓度范围内，可获得高于85.64%的菌体存活率。

2.3.3 结果验证 采用Design-Expert7.0软件，以求得最大菌体存活率为目标，在所得到的30种配方组合中分析筛选出最佳浓度配比为：脱脂乳浓度为6.56g/100mL、海藻糖浓度为2.35g/100mL、甘油浓度为2.47g/100mL，在此基础上得到菌体存活率的理论预测值为87.49%。以筛选出的最佳浓度配比进行9组验证实验，平均菌体存活率值为86.69%，实测值与预测值相吻合，说明响应面法建立的数学模型准确可靠。

3 结论

由回归方程的方差分析得出：回归方程失拟项不显著（P=0.0645），相关系数R2=99.43%，P＜0.0001，说明回归方程拟合非常好，建立的数学模型有实际的应用意义；回归方程的一次项、二次项F检验表明脱脂乳、海藻糖和甘油对菌体存活率的影响均比较显著，说明筛选的因素对冻干过程中鼠李糖乳杆菌的菌体细胞有显著保护作用；由响应面图和等高线图以及回归方程交互项的F检验可知：脱脂乳与海藻糖、海藻糖与甘油对菌体存活率影响的交互作用高度显著，脱脂乳与甘油的交互作用不显著。响应面分析法得到的冻干保护剂最佳配方为：脱脂乳浓度6.56g/100mL、海藻糖浓度2.35g/100mL、甘油浓度2.47g/100mL，在此条件下，菌体存活率值为86.69%，该配方有较强的实用价值。

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Study on optimization formula of cryoprotectants for Lactobacillus rhamnosus by response surface methodology

XU Na1，2，LIU Qing-mei2，*，YANG Xing-min2
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Key Lab of Agricultural Processing Technology of Ningbo，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

In the processing of lyophilization for the directed vat set starter cultures of lactic acid bacteria，the total amount of cell population and fermentative activity was reduced.The optimization formulation of cryoprotectants for Lactobacillus rhamnosus was optimized with the way of response surface methodology which joined by Plackett-Burman design and the steepest ascend method.The results indicated that:The skimmed milk，trehalose and glycerol all significantly affected the survival rate of the Lactobacillus rhamnosus. The interaction between skimmed milk and trehalose was remarkable，so as the reaction of trehalose and glycerol，but the interaction between skimmed and glycerol.The research concluded the optimum of cryoprotectants as follows:The skimmed milk 6.56g/100mL，trehalose 2.35g/100mL，glycerol 2.47g/100mL.By using this process，the optimal cell survival rate was observed to be 86.69%，which was closed to the theory model and had the features of practicability.

Lactobacillus rhamnosus；response surface methodology；cryoprotectants；survival rate；optimization formula

TS201.1

B

1002-0306（2012）01-0207-04

2011－09－08 *通讯联系人

许娜（1986－），女，硕士在读，研究方向：农产品加工。

国家星火计划项目（2010GA01009）；宁波市招标项目（2010C100017）。