HPLC法测定蒙药白葡萄中齐墩果酸的含量Δ

赵子龙，薛培凤，王 丽，王 静，赵 凯（内蒙古医学院，呼和浩特 010059）

白葡萄为葡萄科植物欧洲葡萄Vitis vinifera L.的干燥成熟果实[1]，蒙药名为查干-乌珠莫[2]，主要分布在新疆、甘肃、内蒙古等地区。它具有清肺、止咳、平喘、滋养的功效，用于治疗肺热咳嗽、痰喘、麻疹、口渴等。白葡萄中含有葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖，酒石酸、草酸、枸橼酸、苹果酸、白藜芦醇、齐墩果酸、原花青素等成分[3，4]，其法定标准载于《中华人民共和国卫生部药品标准（蒙药分册）》，但该标准中仅有显微鉴别项。因此，本试验建立了白葡萄中齐墩果酸的含量测定方法，为评价该蒙药材的质量提供依据。

1 仪器与试药

LC-20AT高效液相色谱（HPLC）仪，含紫外-可见检测器、LC-20AT色谱工作站（日本岛津公司）；AB135-S分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KH3200E超声清洗机（昆山禾创超声仪器有限公司）。

齐墩果酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110709-200505）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。13批白葡萄药材采（收）集自新疆各地，经内蒙古医学院药学院鞠爱华教授鉴定均为葡萄科植物欧洲葡萄V.vinifera L.的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[5]

色谱柱：依利特Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.2%磷酸水溶液（85∶15）；检测波长：220 nm，流速：1 mL·min－1；柱温：室温；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含齐墩果酸0.3576 mg的溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液 取切碎的本品（不超过5 mm）适量，置冰箱中冷冻后称取20 g，与4 g硅藻土混合，用小型高速粉碎机粉碎，取粉末2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇45 mL，静置30 min，超声处理（功率：150 W，频率：50 kHz）30 min，滤过，洗涤滤渣，合并滤液，蒸干，残渣用甲醇转移至10 mL容量瓶中并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 取硅藻土0.5 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性试验[6]

取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件分别注入HPLC仪测定，记录色谱图。结果，齐墩果酸峰的保留时间约为15.2 min，与相邻杂质峰的分离度＞1.5；在该色谱条件下，阴性对照溶液对样品测定无干扰。色谱见图1。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取上述对照品溶液（浓度：0.3576 mg·mL－1）5、8、10、12、15、20 µL，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以峰面积积分值（Y）对进样量（X，μg）进行线性回归，得回归方程为Y＝199914X－27830（r＝0.9999，n＝6）。结果表明，齐墩果酸进样量在1.788～7.152 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定5次。结果，RSD＝1.51%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液适量，室温放置，按“2.1”项下色谱条件分别于0、1、3、5、7、12、24 h进样测定。结果，RSD＝1.98%（n＝7），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批样品适量，共6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，样品平均含量为0.08%，RSD＝1.21%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的样品适量，共6份，分别精密加入一定量齐墩果酸对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 样品含量测定

取不同产地白葡萄药材共13批次，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述方法测定样品中齐墩果酸的含量，结果见表2。

3 讨论

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

白葡萄含糖量高，不易粉碎，只能切成碎块，但直接切碎后的碎块极易重新黏附聚集，导致取样不均、重复性差。经摸索，样品切碎成不超过5 mm小块后，必须置冰箱中冷冻，然后再加入一定比例的辅料，并用小型高速粉碎机才可粉碎均匀，从而解决了上述问题。

试验先考察辅料种类和用量对药材粉碎难易程度和药材分散均匀程度的影响。经过比较，药材与淀粉、滑石粉、硅藻土分别以10∶7、2∶1、5∶1的比例混合，可使粉碎均匀。由于3种辅料对含量测定均无影响，在参考文献[7]的基础上，最终选择硅藻土作为添加辅料。

综上所述，本方法准确、专属性强、重复性好，可作为蒙药白葡萄中齐墩果酸的含量测定方法。

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草（蒙药卷）[M].上海：上海科学技术出版社，2004：369-370.

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准蒙药分册[S].1998：12.

[3]马 龙，刘 涛，向 阳，等.新疆葡萄中3种生物活性物质的含量分析[J].中国食品卫生杂志，2006，18（1）：28.

[4]王劲松.葡萄与葡萄酒中白藜芦醇的含量及其影响因素[J].宁夏农林科技，2003，6：81.

[5]廖丽红，曾英彤，梁海勇.RP-HPLC法测定滋阴舒肝颗粒中齐墩果酸的含量[J].中国药房，2008，19（24）：1896.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录36.

[7]王春胜，魏魁东，刘茂军，等.冠脉丸质量标准的研究[J].中草药，2007，38（10）：1518.