抗栓用参环毛蚓水提取方法的筛选

汤兵，孙胜宇，魏文扬，阎婷

(辽宁医学院药学院，辽宁 锦州 121001)

参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)为巨蚓科Megascolecidae 环毛属Pheretima 动物。习称广地龙，为常用中药，中药地龙在中国药典中收录的品种还有通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen)，栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen 的干燥体。后三者习称为“沪地龙”［1］。蚯蚓始载于《神农本草经》，性寒，味咸，归肝、脾、膀胱经。具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效。2010 版药典对参环毛蚓质量控制只有性状和理化鉴别，未有含量测定项。本实验利用溶栓活性的效价测定方法对其水提工艺进行考察，弥补了药典的不足，为把参环毛蚓开发成为抗栓新药提供依据。

1 仪器与试药

仪器:培养箱(美国科峻仪器公司)，高速冷冻离心机(美国索福仪器公司)，培养皿，游标卡尺。

试药:参环毛蚓购于广西，经辽宁中医药大学杨松松教授鉴定为参环毛蚓Pheretima asperillum(E.perrier)的正品;凝血酶 (批号:200921)、纤维蛋白原 (批号:200827)、尿激酶 (批号:200918)均购自中国药品生物制品检定所，重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计

根据水提预实验结果，地龙药材粉碎，采用水为提取溶剂，选取加水量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)为考察因素，每个因素选取3 个水平，进行正交试验。因素水平见表1。

表1 因素水平表

2.2 试验方法及考察指标

取鲜品地龙9 份，每份10 g，按正交设计表进行试验，加水后，浸泡，离心，吸取上清液，分别合并上清液，加水至100 mL，摇匀，精密吸取2 mL，至10 mL 的量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液。为保证产品质量的可控性及先进性，以反映产品质量的主要试验数据即表示溶栓效价的溶圈大小作为考察指标。

2.3 溶栓效价的测定

2.3.1 纤维蛋白平板的制备

纤维蛋白原溶液 取牛纤维蛋白原标准试剂适量(以可凝固蛋白计)，加生理盐水－磷酸缓冲液(pH=7.8)的稀释液(16∶1)的混合液，制成每1 mL 中含可凝固蛋白2.5 mg 的溶液，即为纤维蛋白原溶液。

凝血酶溶液 取牛凝血酶标准试剂适量，加磷酸盐缓冲液(pH =7.8)稀释液，制成每1 mL 含凝血酶30BP 的溶液，即得凝血酶溶液。

纤维蛋白平板的制备 取直径10.0 cm 的空白平皿，置水平的玻璃板上，加纤维蛋白原溶液15 mL，快速滴入凝血酶溶液0.3 mL，边加边平行快速摇匀，静置30 min，使其凝固，备用。

2.3.2 对照品溶液的制备

取尿激酶对照品，加生理盐水使溶解，振摇，制成每1 mL 含尿激酶100 U 的溶液。

2.3.3 测定法

精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，点于同一预先制备好的平板上，于37 ℃恒温条件下放置18 h，用卡尺精密量出各流份及对照液的溶圈直径及垂直于最大直径的另一直径，按下式计算效价。

溶圈面积= (溶圈两直径的平均值)2

测定结果见表2，方差分析见表3。

表3 方差分析结果

由试验结果的方差分析表3 得出，提取次数(C 因素)与加水量(A 因素)为显著性因素，从直观分析极差中可看出，影响本实验的主要因素C＞A ＞B，即:提取次数＞加水量＞提取时间。但考虑到生产实际及成本，生产的下一步应是冷冻干燥，应尽量减少水分的增加，所以本工艺定为提取2 次，第一次加水4 倍量，浸泡30 min，离心，取上清液，第2 次加水3 倍量，浸泡30 min，离心，取上清液，合并上清液，冷冻干燥，即得。

2.4 验证实验

按优选工艺进行验证实验，结果表明参环毛蚓中溶栓活性以尿激酶效价计，为300 U/g。结果表明该工艺稳定可靠。

3 讨 论

蚯蚓具有溶栓作用，其有效成分是蛋白酶［2－3］，因此水提取有效成分含量较高。可考虑进一步用盐析法精制，以提高溶栓效价。

［1］国家药典委员会编.中华人民共和国药典一部［S］.中国医药科技出版社，2010:113.

［2］孙秀英，王富珍，王福星.中药地龙研究进展［J］.中国中医药信息杂志，2009，16 (5):102.

［3］张东方，周美环，单玉，等.参环毛蚓中纤溶活性蛋白酶研究［J］.药物生物技术，2006，13 (1):49－50.