中西药联合对人胃癌SGC-7901/ADR细胞Bcl-2与Bax基因表达的影响

黎 敏 李翠文 侯培珍

包头医学院第一附属医院消化科,内蒙古包头014010

肿瘤细胞对凋亡的耐受是多药耐药(MDR)的重要机制之一,Bax、BCL-2是调控凋亡的关键基因,是通过抑制肿瘤细胞的凋亡而导致耐药的发生[1].笔者前期的研究发现班贞1号、TMP联合5-FU对人胃癌SGC-7901/ADR细胞有较强逆转作用[2]该研究试图从细胞凋亡的角度探讨其逆转人胃癌SGC-7901/ADR细胞耐药的机制,为胃癌MDR的治疗提供新方法.

1 材料与方法

1.1 细胞系

由第四军医大学西京医院消化研究所惠赠的人胃癌耐阿霉素细胞株SGC-7901/ADR细胞.

1.2 药物、试剂与仪器

①药物与试剂:斑贞1号:斑蝥、女贞子、露蜂房、山茱萸按一定比例制备(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院),原生药含量:0.2 g/mL,4℃保存.TMP(浙江新华制药有限公司)、RPMI1640(美国GIBCO公司产品)、5-FU(南通精华制药有限公司产品)、新生小牛血清(赛默飞世尔生物化学制造(北京)有限公司),四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(美国Sigma公司产品).②仪器:PCR扩增仪(美国AB公司),RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 细胞处理于实验两周前培养于不含ADM的培养液中取对数生长期的SGC-7901/ADR细胞,以5X104/mL接种于6孔板上,2 mL/孔,培养24h后,分别在实验孔加入等量如下试剂:A:新培养液(对照组),B:5-FU稀释液(5-FU组);C:班贞1号稀释液(班贞1号组);D:班贞1号+5-FU稀释液(班贞1号+5-FU);E:班贞1号+5-FU+TMP稀释液(班贞1号+5-FU+TMP);各组药物浓度依之前MTT试验的结果,选取对应的IC50值).继续培养48h后,用PBS缓冲液冲洗1次,准备提取总mRNA.

1.3.2 RT-PCR检测(PCR方法按照文献提取组织RNA,)采用Trizol试剂盒提取RNA,引物均由大连宝生物工程有限公司合成,用于特异性扩增的Bcl-2基因序列的正义列引物为5-TCTCTCCC

GACATGACCGAGG-3',反义列引物为5-CCAGGAATATGCCCCGACTTC-3,Bax基因序列的正义列引物为5'-ACCACCCTGGTCTTGGATCC-3',反义列引物为5'-GCGTCCACCAAGAAGCTGAG-3,-action的正义列为5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3',反义列为5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3',先逆转录出cDNA,每个样品反应体系25 uL,即ddH2O13.5 uL,10XPCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 ul,dNTP Mixture 2 uL,Takara Taq 1 uL,目的基因上、下游引物各0.5 uL,各样品cDNA5 uL,灭菌蒸馏水13.5 uL.Bcl-2扩增条件:预变性94℃、2 min;变性94℃、30 s,退火45℃、30 s,延伸72℃、1 min,35个循环;最后72℃、延伸8min.Bax扩增条件:50℃、2min;95℃、10min;95℃、15 s,60℃、1 min,40个循环,最后72℃、延伸8 min.扩增结束后,取样品10 uL,100 V恒压,2%琼脂糖电泳60 min.紫外反射透射分析仪采集电泳图像,凝胶图象分析系统扫描得到各电泳带平均光密度值,目的条带与内参条带光密度比值为相对光密度值(relative optical density,ROD).

1.3.3 统计方法所有数据均采用SPSS 14.0软件进行统计分析,

2 结果

2.1 经不同药物处理后SGC-7901/ADR细胞的Bcl-2、Baxm-RNA表达变化

RT-PCR检测Bcl-2、BaxmRNA表达的变化(图1、2)、凝胶成像分析结果(表1)显示,5-FU组与阴性对照组相比,Bcl-2、Bax mRNA表达及Bcl-2/Bax比值无明显差异(P>0.05).中西药联合组BaxmRNA表达明显增高,Bcl-2mRNA表达及Bcl-2/Bax比值明显降低,与阴性对照组及其他实验组比较有统计学意义(P<0.05).

3 讨论

研究表明,产生耐药的原因之一是肿瘤细胞的凋亡调节失调.有核细胞在凋亡刺激信号作用下通过启动细胞内死亡机制,经过一系列信号转导途径,最终发生细胞程序性变性和死亡的过程谓之细胞凋亡(apoptosis).Bcl-2基因家族在控制细胞凋亡过程中发挥重要的作用,Bax是Bcl-2基因家族中能够促进细胞凋亡的蛋白,Bcl-2是抑制细胞凋亡的蛋白.Bax过表达可促进细胞死亡,而Bcl-2过表达可阻断或阻碍化疗药物诱导细胞凋亡,抑制Bax引起细胞凋亡的功能,使癌细胞对化疗药产生耐药[3-4].因此Bcl-2/Bax的比值决定了细胞受凋亡因素刺激后的生与死[5-6].我们前期研究发现SGC-7901/ADR细胞对5-FU具有耐药性,相对耐药性为97.49[7],该研究结果表明5-FU组Bcl-2、Bax mRNA表达量及Bcl-2/Bax的比值与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),说明Bcl-2、bax蛋白参与耐药细胞对5-FU的耐药性,推测Bcl-2、Bax基因参与SGC-7901/ADR细胞的多药耐药.

斑贞1号合剂以女贞子、山茱萸为辅佐药,以斑蝥、露蜂房为主药,各成分按成人(60 kg)的临床用量制备.其中斑蝥素可抑制肿瘤细胞DNA和RNA合成,具有以毒攻毒、解毒杀瘤、直接杀伤肿瘤且无骨髓抑制作用[8].女贞子能调节细胞毒性T细胞,保护致突剂诱发的突变效应和染色体损伤[9].作为一种中药钙离子通道阻滞剂,TMP可通过多种途径治疗肿瘤,逆转多药耐药作用[10].该课题组研究证明:"斑贞1号对SGC-7901/ADR细胞存在逆转作用[11];300 mg/L的TMP能有效提高SGC-7901/ADR细胞对5-FU的敏感性,使其相对耐药性降至12.89,逆转指数为8.43倍."[7]且中西联合用药对SGC-7901/ADR细胞的逆转作用更为显著[12].该研究结果显示,SGC-7901/ADR细胞经中西药联合组处理后,baxmRNA表达量与斑贞1号、斑贞1号+5-FU组比较明显增高,而Bcl-2mRNA表达量及Bcl-2/bax比值明显降低(P<0.05),提示中西药联合可提高Bax的表达,抑制Bcl-2的表达,促进了SGC-7901/ADR细胞凋亡.这种凋亡可能是受到抑制凋亡基因Bcl-2表达下调和促进凋亡基因Bax表达上调的调节,进一步证实其对耐药细胞的显著逆转作用.关于体外试验结果能否在体内发挥相同的作用,则有待进一步研究证明.

表1 SGC-7901/ADR细胞经不同药物处理后Bcl-2、Bax的表达及Bcl-2/Bax mRNA

图1 SGC-7901/ADM细胞经不同药物处理后Bax mRNA表达

图2 SGC-7901/ADM细胞经不同药物处理后Bcl-2 mRNA表达

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