耐药结核病的实验室诊断及药物相关性研究

魏建林

河北省邢台市第二医院检验科，河北邢台054001

结核病为现今世界上最为普遍和严重的人类传染病之一，早期诊断有利于疾病的治疗及预防[1]。但缺乏特异性的抗原阻碍了结核病早期快速诊断及高保护性疫苗的研制[2]。为了探讨以ASN及DH单独或者联合INH及RFP初步对耐RFP结核菌进行研究，该论文2011年9—12月将用多色流式细胞术检测ELISPOT筛选所得的6条肽段的细胞免疫特性，检测指标为多肽特异性淋巴细胞 (CD4+或CD8+T细胞)分泌的细胞因子TNF-a，IL-4,IFN-y及同时分泌两种因子的情况。

1 实验技术路线

2011年9—12月，对耐药结核病的实验室诊断及药物相关性进行实验室研究工作，具体实验技术路线如图1所示。

图1 青蒿素类耐药实验及逆转

2 青蒿素类单体对耐多药结核分枝杆菌的敏感性实验

2.1 目的

该研究针对耐INH结核菌和耐RFP结核菌进行研究。以DHA(二氢青蒿素)和ASN（单体青蒿琥酯）单独或者联合INH以及RFP对其作初步研究，研究其是否具有杀死细菌，或者抑制细菌生长的作用;中药单体配合RFP或INH是不是具有逆转或协同结核菌耐药性可以通过MB/BACT系统检测。

2.2 材料

按相关规程——《结核病诊断细菌学检验规程》对某所赠与该院的结核分枝杆菌H37Rv标准株进行鉴定 （临床分离株为该院微生物室保存）[3]。

对绝对浓度法药物敏感实验采用罗氏鸡蛋固体培养基的方法进行。INH的耐药临界值15 g/mL、RFP的耐药临界值505 g/mL，在该次实验中，一共具有13株菌株：MDR-TB：0株；INH敏感及RFP：I株；单耐 INH 或 RFP：1 株。

2.3 试剂

①Middle broth 7H9干粉:BD DIFCO公司产品。②OADC:购自上海市结核重点实验室。③米氏7H9液:Middle broth 7H9干粉（4.7 g）；丙三醇2 mL；加1 L去离子水，高压灭菌后无菌添加100 mL OADC。④二氢青蒿素液:用灭菌去离子水溶解，用灭菌去离子水稀释到20 mg/mL。⑤二青蒿琥酯液:用附带的NaHCO3（1 mL）溶解，稀释到20 mg/mL（用灭菌去离子水）。⑥96孔细胞培养板:CORNING公司产品。⑦RFP,INH,Resazurin(刃天青)。⑧Bact/alert MP瓶及营养液。⑨金胺0-苯酚染色法。

2.4 方法

2.4.1 二氢青篙素及青蒿琥酯的抑菌作用 参照刃天青氧化还原显色法检测结核菌在含药微量液体培养基中生长情况。简述如下:用0.5%Tween 80生理盐水研磨结核菌至乳浊状后略沉淀，去其上层面的菌液，调至1个麦氏单位（用米氏7H9液），之后对其进行稀释，稀释比例为：1∶10。将稀释厚的液体加于孔板中（每孔加100 μL），之后，将稀释后的青蒿素单体液加于孔板（每孔加入100 μL），使药物终浓度为2 005 g/mL。对于无菌对照孔，加稀释后的青篙素单体液 100 μL以及 7H9液100 μL。对于无药生长对照孔，加相应菌液及7H9液各100 μL。直至第4天，将各孔中均加入20 μL刃天青贮存液，之后对各孔的颜色进行详细观察和记录（由蓝色变为紫红色的程度），第14天，将各孔液体吸出，并进行金胺O-苯酚荧光染色。

2.4.2 耐药菌的作用 按照MBBACT240操作手册进行，比较耐药菌在含药液体培养基中的生长速度。为使青蒿素类单体逆转细菌耐药，先将青蒿素类单体与细菌相应作用24 h后，再加入营养液及RFP或INH。操作步骤简述如下:用旋涡震荡器将菌浓度为1个麦氏单位的阳性结核瓶震荡1 min后备用。一株细菌共标记7只结核培养瓶，（GC.RFP/GC.INH/DHA.RFP/ASN.INH/GC.INH/ASN.RFP/DHA）;7只瓶中均注入相应青高素单体药液 (用生理盐水代替青蒿素类单体注入GC.INHIGC.RFP/GC瓶)及菌液各0.5 mL，注入后要求瓶内DHA或ASN终浓度为200 μg/mL;24 h后，取出将瓶置MBBACT培养仪，将营养液及INH或RFP贮存液(除 GC瓶外)各注入 0.5 mL，使终浓度为 2 μL/mL，最后将瓶上机培养。

2.5 统计方法

对收集的数据运用统计软件SPSS11.5软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，进行t检验。

3 结果

二氢青蒿素及青蒿琥酯的抑菌作用：通过观察实验结果发现：无菌对照孔没有变色，其他对照孔均存在变色现象。在14 d内，无药对照生长孔和青蒿素单体孔虽未能变为完全粉红色，但都变为粉红色或接近粉红色；金胺O-苯酚荧光染色显示无药对照孔及青蒿素单体孔均为抗酸阳性，且细菌成团荧光明显增强，这就表明青蒿素单体孔和生长对照孔均有分枝杆菌生长，说明此两者均不能单独抑制结核分枝杆菌生长。

经Fisher's exact test统计学处理后显示(数据不在此一一列出)，与相应INHIGC或RFP/GC相比，青蒿素类单体联合INH或RFP其单侧P值均远＜0.05，显示差异有统计学意义。

表1 RFP及INH联合青篙素类单体对11株耐RFP或INH结核菌的效果

通过对青蒿素类联合RFP作用耐RP结核菌的阳性检测时间、RFP及INH联合青蒿素类单体对11株耐RFP或INH结核菌的效果、青蒿素类联合INH作用耐INH结核菌的阳性检测时间得出的数据分析得出：对耐药结核菌，青蒿琥酯及二氢青蒿素联合INH或RFP均表现出了良好的敏感性，推测有逆转耐INH或RFP的作用。以上实验数据还说明一个结果：二氢青蒿素的敏感率没有青蒿琥酯的高。

4 讨论

此次实验，少数试验菌株MP仪器法的结果与其罗氏法药敏的结果比较，差异有统计学意义，针对这种形象，我国有许多学者对其进行了研究分析[4]，认为其主要原因在于：MP系统药物浓度及结敏结果更为准确是因为其培养时间短，药物降解更低。

该研究在设计时，为了延长青蒿素联合RFP与RFP/GC的时间差，缩短RFP/GC与GC时间差，考虑将RFP浓度定为25 g/mL，这种做法是为了更好地体现青素单体联合抗菌药物的作用，并试图更好地将单体的效果体现出来。

通过该身实验，可以得出以下结论：体外单独应用青蒿琥酯或二氢青蒿素不能将结核分枝杆菌杀死或者将其抑制。通过对在此次进行的显色试验结果进行分析，得出：在相同的培养时间内，对不同配合体的孔板进行认真观察，有少数对照孔的颜色没有含药孔的颜色红，MP法中亦有菌株3081其RFP/ASN瓶比GC瓶早报阳2.7 d，这些均表明：某些结核分枝杆菌的生长可能由青蒿素类单体引起[5]。

通过该研究可以得出：对于耐药结核分枝杆菌，INH或RFP联合二氢青蒿素或青蒿琥酯是有效的，且青蒿琥酯比二氢青蒿素的敏感率高，其机制可能是协同或者逆转细菌的耐药程度。

[1] 蔡江丽,秦莲花.结核分枝杆菌分泌蛋白64抗体适应的获得及血清学检测[J].中华结核和呼吸杂志,2010,33(4):309-310.

[2] 王庆,金玉莲,李建农.四种方法检测结核分枝杆菌耐药性结果的比较及方法评价[J].中华传染病杂志,2007,25(11):690-694.

[3] 陈芳,曾杰.DC-SIGN特异性适体的筛选及鉴定[J].细胞分子免疫学杂志,2008,24（12）:1133-1136.

[4] 张慧卿,方念.适体筛选技术[J].中国生物工程杂志,2008,28（1）:113-118.

[5] 甄蓓,宋亚军.体外筛选碳疽芽饱适体[J].生物化学与生物物理学报,2002，34（19）:635-642.