均匀设计实验优选白毛夏枯草中总黄酮的提取工艺

涂爱国，徐国莲

（江西中医药高等专科学校，江西 抚州 344000）

现代研究表明，黄酮类化合物有明显的抗氧化、抗炎、抑菌、抗癌及降血脂等生物活性，已广泛应用于食品和医药行业[1]。白毛夏枯草为唇形科植物筋骨草属金疮小草（Ajuga decumbens T hunb.）的全草，主要分布在秦岭以南各省区。白毛夏枯草性味苦寒，民间主要用于止咳化痰、清热、凉血、消肿、解毒，治疗腹泻、肝炎、疔毒疖肿、外伤出血等[2]。现代药理研究证明，白毛夏枯草具有保肝利胆、镇咳、祛痰、平喘等作用[3]，其主要有效成分为黄酮。本实验采用均匀设计法安排实验，优选出合理的总黄酮提取工艺，为生产工艺参数的选择提供实验数据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DK-98-I电子恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），十万分之一天平（北京赛多利斯天平有限公司），TU-1901双波长紫外可见分光光度计（北京普析仪器有限公司），JJ200型电子天平（常熟市双杰测试仪器公司），KQ-100型超声仪（昆山市超声波仪器厂）。

1.2 试药

芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；化学试剂均为分析纯；白毛夏枯草药材于2008年7月采购自樟树药材市场，经江西中医药高等专科学校李秀英副教授鉴定为唇形科植物筋骨草属金疮小草（Ajuga decumbens T hunb.）。

2 方法与结果

2.1 白毛夏枯草总黄酮含量的测定

2.1.1 供试品溶液的制备 精确称取过40目筛的白毛夏枯草药材3份，每份10g，加100mL乙醇，采用热回流法提取。每份平行提取两次，过滤，合并滤液并定容至250mL容量瓶中，即得供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 精确称取在110℃干燥至恒重的芦丁对照品12mg，置于50mL容量瓶中，加适量甲醇使其溶解后，加甲醇至刻度，摇匀，精确吸取20mL置于50mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.1.3 测定波长的选择 精确吸取对照品溶液3mL和供试品溶液0.2mL分别置于25mL刻度试管中，各加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠溶液10mL，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白溶液，分别在400～700nm波长范围内进行扫描。结果：对照品和供试品溶液在510nm处有最大吸收，且光谱形状极为相似，形成的络合物在常温下稳定性好，满足分光光度法测定的基本要求。因此，选定510nm作为测定波长。

2.1.4 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分别置于25mL刻度试管中，各加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠溶液10mL，加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白溶液，以紫外-可见分光光度法在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。得到回归方程为：A=11.48C+0.053，R=0.998，对照品芦丁的浓度在0.0052～0.0386mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.1.5 精密度实验 精密量取同一供试品溶液0.5mL，按2.1.3项操作，平行测定5次，相对标准偏差（RSD）为1.1%，表明该方法精密度良好。

2.1.6 重复性实验 取同一供试品溶液5份，每份精密量取0.5mL，按2.1.3项操作，测定，RSD为1.5%，表明该方法重现性良好。

2.1.7 稳定性实验 在室温条件下，精密吸取同一供试品溶液，在0小时、2小时、4小时、6小时、8小时内分别测定A值，分别为0.589、0.599、0.594、0.596、0.590，计算其 RSD为 0.3%，说明供试品溶液在8小时内稳定。

2.1.8 回收率实验 精密吸取已知总黄酮含量的同一供试品溶液0.5mL，取5份，分别精密加入对照品溶液适量，按2.1.3项操作测定吸光度，得出总黄酮含量，计算出加样回收率。结果，平均回收率为94.2%，RSD为1.6%，表明该法回收率良好。

2.2 均匀设计实验

均匀设计法由方开泰研究员和数学家王元在1978年共同提出，它是将数学论和多元统计相结合的一种新颖的实验方法，其核心思想是用确定性方法寻找空间中均匀分布的点集来代替Monte carlo中的随机数，它通过提高实验点“均匀分散”的程度，使实验点具有更好的代表性及能用较少的实验获得较多的信息。

2.2.1 因素水平及指标的确定 采用乙醇回流提取白毛夏枯草总黄酮，主要影响因素为乙醇浓度（%）、料液比、提取时间（h）3个因素，故以此三因素为参考水平，共设9个水平进行均匀设计实验，优选最佳提取条件。用U9（93）均匀设计表安排实验，以总黄酮含量为评价指标。因素水平见表1。

2.2.2 实验安排及结果 按2.1.1项方法制备供试品溶液，分别精密吸取1～9号各0.5mL，按2.1.3项操作。测定其在510nm处吸光度A。由回归方程计算出总黄酮含量，并进行方差分析。均匀设计实验安排及结果见表2，方差分析结果见表3。

将表3数据输入计算机，通过王玉方“均匀设计”3.00软件进行数据处理，采用逐步回归（后退法）进行多元线性回归处理，得多个多元回归方程，最后优选确定回归方程为Y=-0.924+0.0267A+0.0527B+0.0941C。由表 3可知，F=10.86，P<0.05，回归方程在α=0.05水平上有显著意义，通过计算方程中各项对回归的贡献:C>B>A。依据回归方程和实际经验，选择白毛夏枯草中总黄酮的提取工艺为料液比1∶25，乙醇浓度80%，提取时间两小时，总黄酮含量预期值为4.86%。

2.2.3 验证实验 根据优化工艺进行总黄酮的提取，制备3批样品，测定其中总黄酮含量，见表4。得平均值Y=4.69%，与理论推测值相近，在其范围区间内。

3 讨论

均匀设计法在条件范围变化大而需要进行多水平实验的情况下，可极大地减少实验的次数，它只需要与因素水平数相等次数的q次实验即可获得正交设计的至少做q2次实验所能获得的实验结果。均匀设计只考虑实验点在实验范围内充分“均匀散点”，而不考虑“整齐可比”，因此实验的结果没有正交实验结果的整齐可比性，其实验结果的处理多采用回归分析方法。均匀设计实验不仅能找到最优的实验条件组合，还能建立可定量描述指标和因素间关系的数学模型[4]。

通过均匀设计实验结果分析，确定提取次数为影响白毛夏枯草总黄酮提取率的主要因素，影响显著;而溶剂用量和乙醇浓度对白毛夏枯草总黄酮提取率的影响很小，不显著。最后确定最佳提取工艺为料液比1∶25，乙醇浓度80%，提取时间2小时。均匀设计实验验证结果与预测结果基本接近，表明该提取工艺稳定、可行。

表1 因素水平

表2 均匀设计实验安排及结果

表3 方差分析

表4 验证实验结果（n=3）

[1]许瑞波，曹晓英，王明艳.睡莲叶黄酮的提取及其抑菌活性研究[J].食品科技，2009，34（4）：190-197.

[2]南京中医药大学.中药大辞典[M].2版.上海∶上海科学技术出版社，2006.

[3]马志平，黄榕.筋骨草有效部位黄酮类粗品的保肝试验[J].海峡药学，2002，14（5）：40-41.

[4]方开泰.均匀设计——数论方法在试验设计的应用[J].应用数学学报，1980，3（4）：363.