美沙拉嗪对溃疡性结肠炎患者肠黏膜紧密连接蛋白表达的影响

姜宗丹 张振玉* 孔超美 赵有财 王劲松 黄文斌

南京医科大学附属南京医院消化科1(210006) 病理科2

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)、克罗恩病(Crohn’s disease，CD)，其发病率逐年增高，但发病机制尚未完全阐明。目前认为肠黏膜屏障功能失调参与了UC的发生。

肠黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障等组成，其中机械屏障由黏膜上皮细胞及其各种连接结构所构成。位于上皮细胞顶端的紧密连接是构成上皮机械屏障功能最主要的结构，可维持细胞极性和通透性，在大分子物质是否通过屏障的过程中发挥关键作用。紧密连接一旦发生变异、损伤、降低或缺失，会引起细胞间隙通透性增加，从而引起肠黏膜损伤。occludin和 ZO-1(zonula occluden-1)是构成紧密连接的主要跨膜蛋白的重要组成部分，参与细胞间黏附、移动、调节细胞通透性以及细胞表型的改变［1］。本研究通过采用免疫组化法检测美沙拉嗪治疗前后occludin和ZO-1蛋白的表达情况，旨在探讨美沙拉嗪对UC肠黏膜紧密连接蛋白的影响。

对象与方法

一、研究对象

选取2010年12月～2011年6月南京医科大学附属南京医院收治的活动期UC患者30例，其中男15例，女15例，年龄 22～58岁，平均(41.5±9.1)岁。诊断标准参照2007年“对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见”，根据临床表现、内镜和组织病理学检查结果作出UC的诊断。排除标准:①对本药物过敏者;②正接受其他5-氨基水杨酸(5-ASA)衍生物治疗(或停用＜1周)者;③伴随其他严重的进展性疾病者;④有肠道切除术史者;⑤妊娠、哺乳期妇女。按Sutherland疾病活动指数来判断UC的轻、中、重度活动期和缓解期，7例轻度活动期，其余为中度活动期。所有病例治疗两个月后复查结肠镜显示均为缓解期。所有患者均签署知情同意书，本研究方案由南京医科大学附属南京医院伦理委员会审批通过。

二、研究方法

1.给药方法和标本采集:患者入选后给予餐后口服美沙拉嗪［希米科医药技术发展(北京)有限公司］1.0 g，3次/d，共8周。分别于患者就诊时和治疗缓解后以内镜活检钳取乙状结肠病变标本2块。

2.免疫组化SABC法:取结肠组织，蜡块切片、烤片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，高温高压抗原修复，非免疫血清封闭。分别加入兔抗人多克隆occludin、ZO-1抗体(均购自 Cell Signaling Technology，滴度均为1∶200)孵育，4℃过夜;加入生物素标记的羊抗兔IgG抗体37℃ 20 min;加入SABC(武汉博士德生物工程有限公司)37℃ 20 min。DAB显色，苏木素复染，常规脱水透明树胶封片。PBS液代替一抗作为空白对照。

结果判断:阳性程度判定标准参照袁小凌等［2］的方法，结果由两位病理医师以双盲法独立观察确定。低倍镜下观察occludin和ZO-1在肠上皮细胞的分布特征，每张切片选取5处occludin和ZO-1染色集中区，高倍镜下(×200)观察并计数，求均值。

三、统计学分析

结 果

一、occludin蛋白

occludin蛋白阳性染色主要定位于细胞质。治疗前occludin蛋白表达较弱，呈淡黄色，阳性细胞率0～10%，以美沙拉嗪治疗后occludin蛋白表达明显增强(P=0.000)(见表1、图1)。

表1 UC患者治疗前后occludin和ZO-1蛋白表达变化()

表1 UC患者治疗前后occludin和ZO-1蛋白表达变化()

组 别 例数occludin ZO-1治疗前30 1.60 ±0.55 1.40 ±0.55治疗后 30 7.20 ±1.55 6.60 ±1.26 t值49.426 1.745 P值0.000 0.000

二、ZO-1蛋白

ZO-1蛋白阳性染色主要定位于细胞质。治疗前ZO-1蛋白表达较弱，呈淡黄色，阳性细胞率0～10%，以美沙拉嗪治疗后ZO-1蛋白表达明显增强(P=0.000)(见表1、图 2)。

图1 治疗前后occludin蛋白的表达(免疫组化SABC法，×200)

图2 治疗前后ZO-1蛋白的表达(免疫组化SABC法，×200)

讨 论

UC的重要特征之一为急性发作时白细胞从血管内游走到肠黏膜造成炎性细胞浸润，即中性粒细胞(PMN)穿过上皮细胞进行迁移，这种现象称为PMN跨上皮迁移。有研究［3］观察PMN跨上皮迁移与结肠上皮细胞连接蛋白的关系，以免疫荧光法检测急性发作期UC患者PMN区和非PMN区结肠黏膜紧密连接蛋白(occludin、claudin-1、ZO-1和JAM)的表达，结果发现急性炎症PMN区所有被测蛋白表达均下降，而非PMN区仅occludin表达下降，因此认为occludin丢失是UC的重要表现，与UC引起的细胞膜渗透性增加有关;其他连接蛋白表达下降仅出现在PMN区，推测这些蛋白下调是 PMN迁移后快速可逆的一个过渡过程。

紧密连接是细胞间连接的重要形式之一，可由claudin蛋白、occludin蛋白、JAM、ZOs等结构蛋白以及各类连接蛋白分子共同组成［4］，occludin是最先分离出来的紧密连接跨膜蛋白［5］，相对分子质量为65 kDa(1 Da=0.9921 u)，包含2个细胞外环和1个短的细胞内环。免疫电镜显示occludin蛋白定位于紧密连接上［6］，其不仅能通过细胞外环以拉链式结合的方式产生严密的细胞旁封闭，还能与不同的分子结合参与紧密连接形成的信号调节［7，8］。occludin与ZO-1可形成紧密连接蛋白的基本结构，功能涉及细胞间黏附、移动、调节细胞通透性以及细胞表型的改变［1］。低氧、炎性因子刺激等病理情况可引起occludin、ZO-1蛋白等分布异常、表达减少甚至融解，导致紧密连接结构和功能的异常，细胞间隙增宽，进而使内皮层通透性升高［9］，发生损伤。电子显微镜证实，紧密连接在炎症损伤中的表达逐渐减少［10］。

美沙拉嗪为5-ASA的控释剂型，定向在回肠末端和结肠释放，可抑制结肠过氧化物酶和黏膜释放白三烯、前列腺素E，抑制巨噬细胞向炎症迁移以及血小板活化因子的活性，消除氧自由基等损伤因子，抑制激活的白细胞产生炎症递质而发挥抗炎作用。UC时肠黏膜屏障功能异常，肠腔内抗原物质向肠黏膜固有层易位并激活固有层免疫细胞，产生大量炎性细胞因子和介质，进一步损伤肠黏膜屏障功能，使肠上皮细胞紧密连接发生变异、减少或缺失，导致细胞间隙通透性增加，从而导致细菌、内毒素和大分子物质通过紧密连接进入体循环［11，12］。美沙拉嗪可抑制激活白细胞产生炎症发挥抗炎作用，从而抑制炎症介导的肠黏膜屏障损伤。

本研究采用免疫组化法发现美沙拉嗪治疗后UC患者肠黏膜上皮细胞occludin、ZO-1蛋白表达均明显升高，患者内镜下取得缓解。说明美沙拉嗪可能通过上调紧密连接蛋白occludin、ZO-1的表达来保护肠黏膜屏障功能，但具体的作用机制仍需进一步探讨证实。

1 刘理，杨宗城，黎鳌.紧密连接的分子基础及其调控［J］.国外医学生理、病理科学与临床分册，1999，19(1):75-77.

2 袁小凌，刘洁，杨淑丽，等.3-MA和PDTC联合应用对大鼠急性坏死性胰腺炎的协同保护作用［J］.胃肠病学，2013，18(2):76-81.

3 Kucharzik T，Walsh SV，Chen J，et al.Neutrophil transmigration in inflammatory bowel disease is associated with differential expression of epithelial intercellular junction proteins［J］.Am J Pathol，2001，159(6):2001-2009.

4 宋红丽，吕飒，马力，等.TNF-α影响肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白的表达［J］.世界华人消化杂志，2004，12(6):1303-1306.

5 Chen YH，Lu Q，Goodenough DA，et al.Nonreceptor tyrosine kinase c-Yes interacts with occludin during tight junction formation in canine kidney epithelial cells［J］.Mol Biol Cell，2002，13(4):1227-1237.

6 Furuse M，Hirase T，Itoh M，et al.Occludin:a novel integral membrane protein localizing at tight junctions［J］.J Cell Biol，1993，123(6 Pt 2):1777-1788.

7 Hirase T，Staddon JM，Saitou M，et al.Occludin as a possibledeterminantoftightjunction permeabilityin endothelial cells［J］.J Cell Sci，1997，110(Pt 14):1603-1613.

8 Nusrat A，Chen JA，Foley CS，et al.The coiled-coil domain of occludin can act to organize structural and functional elements of the epithelial tight junction［J］.J Biol Chem，2000，275(38):29816-29822.

9 Berkes J，Viswanathan VK，Savkovic SD，et al.Intestinal epithelial responses to enteric pathogens:effects on the tight junction barrier，ion transport，and inflammation［J］.Gut，2003，52(3):439-451.

10 Kleeff J，Shi X，Bode HP，et al.Altered expression and localization of the tight junction protein ZO-1 in primary and metastatic pancreatic cancer［J］.Pancreas，2001，23(3):259-265.

11 何新颖，唐志鹏，张亚利.肠上皮屏障与炎症性肠病研究进展［J］.世界华人消化杂志，2008，16(29):3316-3320.

12 秦环龙，高志光.肠上皮细胞紧密连接在肠屏障中的作用研究进展［J］.世界华人消化杂志，2005，13(4):443-447.