白藜芦醇对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及通路的影响

刘长江，严春辉，史 斌

Department of Physical Education，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710049，Shaanxi，China

引发脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)的主要原因有交通事故(45.4%)、高处坠落(16.8%)和运动损伤(16.3%)等，而运动引起的SCI主要出现在跳水、摔跤、体操等项目上［1］。由于SCI是一种严重的神经系统损伤疾病，其损伤机制历来是骨外科、神经外科、运动医学等学科研究的热点。多数学者认为SCI涉及多个环节，如缺血、生化改变、神经细胞凋亡、毒性刺激物、神经递质的积聚、脂质过氧化和自由基的产生和炎症反应等［2］。尤其是近年来研究认为SCI机制中细胞凋亡是十分重要的因素之一，但其机制仍不明确。

细胞凋亡(Apoptosis)亦称为程序细胞死亡，是机体在自身基因控制下的细胞有序死亡方式。研究表明，SCI后神经细胞死亡的方式不仅仅是坏死，同时还广泛存在细胞凋亡［3］。神经细胞的凋亡不仅参与了SCI过程，而且与多种基因的调控有关，如:Bcl－2家族、Caspase 家族及 p38MAPK 等［4－6］。如何抑制神经细胞凋亡，减轻继发性SCI，从而促进运动功能恢复，是SCI的治疗策略之一。白藜芦醇(Resveratrol，Res)具有抗氧化、抑制血小板聚集、调节血脂代谢、抗炎、抗肿瘤等广泛的生理药理学作用［7］。我们前期的研究证实Res对SCI具有保护作用［8］，但Res通过抗凋亡治疗SCI的程度及作用机制还不清楚。本研究通过采用改良Allen’s重物打击法，制成中度脊髓损伤动物模型，观察Res对SCI后神经细胞凋亡及其通路的影响，探讨Res对SCI的抗凋亡作用及其机制，为防治SCI提供理论依据及新思路。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康SD大鼠27只，体质量(280～320)g，雌雄不限，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。实验时间:2011年9～12月;实验地点:西安交大医学院科研中心。将实验动物随即分为3个组:假手术组(Sham组);损伤组(Control组);白藜芦醇处理组(Res组)，每组9只。Sham组仅行手术暴露，不给予打击及治疗;Control组、Res组采用Allen’s打击法建立脊髓中度损伤模型，术后即刻分别给予等量的生理盐水及Res 200 mg·kg－1。Control组注射次数和 Res组一致，每天一次，第3天处死大鼠。实验过程中对动物的处置参照国家科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》［9］。

1.2 脊髓打击损伤模型的建立

大鼠以10%水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于手术台，常规术区备皮，碘伏消毒皮肤，铺无菌手术洞巾。以T8棘突为中心，取后正中纵行切口长约3 cm，蚊钳咬除T8棘突和椎板及相邻T7－9上下各半个椎板，暴露硬脊膜。采用改良的Allen’s装置以25 gcm(10 g×2.5 cm)损伤力度行重物打击法制作大鼠SCI模型。造模成功的判定标准:损伤处脊髓出血、水肿，双下肢呈回缩性扑动，其尾巴出现痉挛性摆动，麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。术后0号线逐层缝合，即刻给予背外侧肌群肌肉注射青霉素5万U预防感染，每天1次，持续3 d。分笼饲养，自由取食，术晨禁食水。每日膀胱按摩2次致自主排尿反射建立。组中动物如有死亡，随时补充。

1.3 主要试剂及仪器

主要试剂:白藜芦醇(Sigma公司，批号:R5010100112K5216);10%水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司，批号:H37022673);青霉素注射液(苏州二叶制药有限公司，批号:H32021320);Bcl－2、Bax、Capase－3、p38 MAPK多克隆抗体;免疫组化SP试剂盒及DAB显色试剂盒(北京博奥森公司);放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitationassay，RIPA)总蛋白提取试剂盒(日本 Takara公司);倒置显微镜(日本Olympus公司);EM902透射电镜(美国Carl Zeiss公司);ECL发光液及NC膜(北京中杉金桥公司)。主要仪器:Allen’s脊髓损伤打击器(西安交大第二附属医院骨科);实验手术器械(上海手术器械厂);Milli－QUF纯水工作站(美国Millipore公司);石蜡切片机(德国LEICA公司)，低温离心机(法国JOUAN公司)，80℃超低温冰箱(美国REVECO公司)，电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技公司)，SDS－PAGE凝胶电泳仪、转移电泳槽(美国BIO－RAD公司);倒置显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 观测指标

1.4.1 电镜观察

术后72h各组取3只大鼠，给予过量乙醚麻醉处死后，取T8损伤节段脊髓组织损伤节段脊髓组织，将标本修成1 mm3的小块并置于2.5%戊二醛固定液中，4℃固定6 h;磷酸盐缓冲液冲洗(pH=7.4)，1%四氧化锇固定1 h;依次用乙醇、丙酮逐级递增浓度脱水;环氧树脂包埋，70℃下聚合48 h;超薄切片机连续切片，片厚60 nm;用醋酸双氧铀和柠檬酸铅溶液进行双重染色;透射电镜观察、拍照。

1.4.2 免疫组织化学检测

术后72 h各组取3只大鼠，同法取 T8损伤节段脊髓组织石蜡包埋、5 μm厚切片。常规脱蜡、后;热修复抗原;每张切片加50 μl内源性过氧化酶阻断剂，室温孵育10 min;PBS冲洗后，每张切片加50 μl正常非免疫动物血清，室温孵育10 min;甩去血清，每张切片加50 μl的兔抗鼠一抗:Bcl－2(1:100)或Bax(1:200)或Caspase－3(1:100)或p38MAPK(1:200)，4℃过夜;PBS冲洗后，每张切片加50 μl生物素的羊抗兔IgG二抗，室温下孵育30 min;PBS冲洗后，每张切片加50 μl辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素溶液，室温孵育20 min。PBS冲洗后，每张切片加100 μl新鲜配置的DAB，显微镜下观察3 min，棕色为阳性;纯化水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。显微观察阳性表达位置及强度。

1.4.3 免疫印迹法(Westen blot)检测

术后72 h各组取3只大鼠，同法取 T8损伤节段脊髓组织，RIPA试剂盒提取总蛋白，10000 g离心取上清，定量并分装;(4:1比例样品/上样缓冲液)混合样品100℃加热变性5 min;配制10%分离胶和4%浓缩胶，上样，10%SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳;根据MARKER的位置切胶，根据胶的大小裁剪 PVDF膜和滤纸，并将膜和滤纸于转膜缓冲液中浸15 min，之后按滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序叠放于转膜板上夹紧，25 mV转膜2.5h;转膜后将 PVDF膜蛋白面朝上于8% 脱脂奶粉液中37℃ 封闭1 h。TBST漂洗三遍。弃去TBST，加一抗Bcl－2或Bax或Caspase－3或p38 MAPK(兔抗大鼠，1:200);37℃摇床摇动2 h，4℃冰箱过夜;弃去一抗，TBST漂洗三遍;加二抗(HRP标记山羊抗兔IgG，1:800);摇床温和摇动3 h;弃去二抗，TBST漂洗三遍，共30 min;ECL发光液发光、凝胶成像系统采集及分析。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 电镜观察

Sham组未检测到凋亡细胞，Control组检测到大量的凋亡细胞，Res组未检测到凋亡细胞，Sham组神经细胞核膜完整，核染色质颗粒细致，分布均匀，线粒体膜无凹陷，粗面内质网未见扩张改变，细胞核圆，未见凋亡小体产生。Control组神经细胞缩小、变形，胞浆空泡化，线粒体嵴断裂(消失)，内质网扩张。核膜内陷，染色质有边集现象，有凋亡小体产生。Res组神经细胞较Control组结构清晰，染色质较均匀，核膜清晰，少见核膜凹陷，粗面内质网结构正常，线粒体结构正常。电镜结果提示Res能明显抑制脊髓神经细胞的凋亡(图1)。

图1 脊髓损后电镜观察

2.2 免疫组织化学检测

Sham组Bax呈极少量表达，Control组Bax则大量表达，Res组Bax较Control组表达明显降低;Sham组Bcl－2呈极少量表达，Control组Bcl－2则呈极少量表达，Res组 Bcl－2表达较 Control组表达有所提高;Sham组Caspase－3、p38MAPK呈极少量表达，Control组Caspase－3、p38MAPK大量表达，Res组与 Control组相比，Caspase－3、p38MAPK表达明显降低(图2)。免疫组化染色提示Res对SCI组织中神经细胞凋亡相关蛋白的表达有较好的调控作用。

2.3 免疫印迹法(westen blot)检测

Sham组Bcl－2、Bax呈极少量表达。Bax在Control组脊髓组织中大量表达(P＜0.05)，而Bcl－2表达较低(P＜0.05)，两者比例失调;Caspase－3及p38 MAPK明显激活(P＜0.05)，神经细胞凋亡增加显著。与Control组相比，Res组Bax蛋白表达明显降低(P＜0.05)，Bcl－2 表达则显著升高(P ＜0.05)，Caspase－3及p38MAPK的激活明显受到抑制(P＜0.05)。提示脊髓组织超微结构损害有所改善，神经细胞凋亡显著减少(图3、图4)。

图3 Westen blot检测凋亡相关蛋白的表达

图4 凋亡相关蛋白表达水平的检测

3 讨论

SCI后，损伤部位除创伤造成的直接损伤外系列级联放大式的继发性病理改变(水肿、出血、钙离子内流、脂质过氧化、微循环障碍、细胞凋亡等)是导致SCI难以治愈的关键。继发性损伤不仅具有可逆性而且具有可调控性，这使得SCI的恢复具有可能［10］。此外，继发性SCI是渐进性的过程，为药物治疗SCI提供了机会，及时有效的干预或治疗可使病变局限，从而促进神经功能恢复。

随着研究的深入，SCI的研究方向已从形态学领域向分子生物学领域发展。研究表明，凋亡不仅发生在发育过程中，也可发生在脑以及SCI后［11］。其后研究证实了细胞凋亡是继发性SCI细胞死亡的重要方式［12］。影响细胞凋亡的因素有多种，如缺血、缺氧、氧自由基等，而且细胞凋亡的调控与多种基因的表达有关，如p38 MAPK信号通路、Bcl－2家族及caspase家族等。目前已知道有多种基因，如Bax、Bcl－2、Fas等均与细胞凋亡相关［13－14］，特别是 Bcl－2和 Bax基因与凋亡的调控关系更为密切，二者是相互拮抗的两个基因，在细胞凋亡的调控中起着重要作用［15］。Bcl－2是主要的抗凋亡基因，它可以抑制多种途径的凋亡。Bax是Bcl－2的拮抗基因，与Bcl－2具有45%的同源性，两者都属于Bcl－2基因家族成员，通过编码相应功能蛋白起作用。Bax可直接和线粒体膜结合，形成线粒体跨膜通道，促进细胞色素C释放，激活Caspase系统，进而促使细胞发生凋亡。Bax/Bcl－2异源二聚体形成的调节是细胞凋亡中非常重要的一个环节，Bax/Bcl－2比值决定细胞的存亡，SCI后Bax/Bcl－2比值增加。研究表明［16］SCI后Bcl－2蛋白仅有少量表达，而Bax蛋白大量表达，提示SCI后促进凋亡因子将会占优势，而保护因子的明显不足，使得神经细胞向凋亡方向发展。

Caspases蛋白酶是目前研究的热点之一，它的激活被作为细胞凋亡的标志。在正常情况下，Caspase－3蛋白是以活性很低的酶原形式存在，Caspase－3被激活后，其构象发生变化，从而发挥凋亡效应，导致凋亡的发生［17］。研究发现［18］SCI后出现细胞凋亡、Caspase－3的激活等，继而脊髓内神经元发生一系列形态及功能变化。研究证实［19］，Caspase－3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。因此，SCI研究中 Bax，Bcl－2，Caspase途径是极其重要的研究途径。有丝分裂原激酶(MAPKs)是一组参与介导细胞外信号由胞外向胞内传递的重要介质，它们在细胞分化、发育、成活和凋亡过程中发挥重要作用。p38MAPK的激活是SCI引起凋亡的重要信号转导通路之一，参与Bcl－2、Bax、iNOS和caspase有关细胞凋亡基因的调控。SCI激活p38MAPK，进而活化下游的转录因子、MAPKAPK2，3及Caspase家族成员，活化的转录因子与顺式作用元件相结合，引起大量与凋亡有关的基因表达，与细胞延迟性死亡密切相关。

继发性SCI是渐进性的过程，继发性损伤不仅具有可逆性，同时具有可调控性，这为药物治疗SCI提供了机会。脊髓继发性损伤引起的微环境变化不是单一因子作用，而是多因子、多因素联合作用的生物共济环，任何侧重于某一方面的药物都无法在整体上解决SCI后的修复。中药作为传统治疗，由于其具有多靶点的综合效应且副作用较小等优势，近年来在SCI机理机制研究方面应用广泛［20－21］。Res化学名为 3，5，4’－三羟基－反－均二苯代乙烯，是广泛存在于葡萄、花生等植物中的一种多酚类化合物，其作为植物药，具有广泛的生理药理学作用［22］。本实验电镜学观察结果显示Res可明显抑制脊髓神经细胞的凋亡。另根据 Bax，Bcl－2，Caspase－3及 p38MAPK 免疫组化染色分析及相关蛋白Western Blot检测，我们可以初步认为，SCI后脊髓组织内Bcl－2表达明显减少，Bax蛋白表达增加，诱导了caspase－3表达，从而导致了神经细胞凋亡。Res可明显对抗上述变化。由此推测Res通过上调Bcl－2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，抑制Caspase－3激活，参与对脊髓神经细胞凋亡的保护。另外，损伤脊髓组织中p38MAPK的蛋白表达水平显著增高，由此证明了损伤脊髓神经细胞的凋亡有p38 MAPK通路介入;在给予Res处理后，p38 MAPK表达下降，提示Res可抑制p38 MAPK激活，从而阻断p38 MAPK介导的信号转导通路，延缓损伤脊髓组织中凋亡的发生，最终及时有效的干预凋亡病变，促进神经功能恢复。

4 结论

本研究结论表明，Res通过提高Bcl－2/Bax蛋白表达比，抑制p38MAPK及Caspase－3的激活，使大鼠脊髓组织超微结构损害有所改善，神经细胞凋亡显著减少，并且可阻断 p38MAPK介导的信号转导通路。提示Res对大鼠SCI组织的神经细胞凋亡有较好的调控作用。

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