β－蜕皮甾酮衍生物前导化合物的合成、分离及鉴定

陈丽秋，迟德富 ，李晓灿，宇 佳

(东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨150040)

β－蜕皮甾酮(又称为β－蜕皮激素、20 －OH －蜕皮激素或20 －OH －蜕皮甾酮)是一类多羟基甾酮类化合物，存在于昆虫和多种植物中［1］。在目前的报道中表明:已从160 多种植物中检测出含有多羟基甾酮类化合物，这些化合物都具有蜕皮活性，其中120 多种蜕皮甾酮类似物的分子结构已经得到证实。这些已证实的化合物为植物源蜕皮激素衍生物分子结构的获得，及人工合成具有高活性的蜕皮激素衍生物提供了直接的理论依据［2］。到目前为止已经有很多研究表明，现已鉴定出来的120 多种蜕皮甾酮类似物中，有多种化合物对昆虫具有比20 －羟基蜕皮甾酮更高效调节蜕皮作用，或具有更高效的杀虫作用［2－10］。但是，多羟基蜕皮甾酮类似物在昆虫体内及植物中含量都比较低［7］。虽然，目前已有从植物中成功提取β－蜕皮甾酮衍生物的相关报道［6］，但是，这些方法在应用于工业生产时需要经过组织培养和添加诱导剂等多道工序，另外β－蜕皮甾酮类似物的结构复杂，提取过程中极易在酸、碱、酶和热的作用下分解，从而使获得物提取成本高昂、且杂质成分复杂，不利于产出物的后续应用［3］。因此有必要利用化学修饰的方法获得β－蜕皮甾酮的衍生物。目前已有研究人员成功合成β －蜕皮甾酮的乙酸酯类衍生物和含氮类杂环衍生物，并通过生测鉴定出β－蜕皮甾酮的22 位羟基是β －蜕皮甾酮发挥高蜕皮活性的的功能基团［8］。而本文是以β－蜕皮甾酮(20 －ECD)作为反应原料，利用脱水剂对蜕皮甾酮的邻位羟基进行化学修饰得到3 种关键性的蜕皮甾酮衍生物的先导化合物。这3 种先导化合物将蜕皮甾酮的活跃羟基选择性地进行保护，以利于其他基团的修饰，定向的合成其他植物蜕皮甾酮衍生物，为以后研究药理活性及其构效关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器设备和实验材料

BrukerARX－300 型核磁共振分析仪测定(TMS 内标);LC－MSD－Trap－SL 型质谱仪测定;旋转蒸发仪。

β－蜕皮甾酮(购于福州日冕科技开发有限公司、纯度为98%);甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等均为天津永大化学试剂有限公司生产的分析纯试剂;薄层分析用硅胶GF254(青岛海立信精细硅胶化工有限公司);快速柱层析所用硅胶为H60(青岛海立信精细硅胶化工有限公司)。

1.2 合成方法［8－10］

1.2.1 20 －ECD 2，3∶20，22 －diacetonide 合成方法 在干燥的反应瓶中加入 β － 蜕皮甾酮110 mg(0.208 mmol)β－蜕皮甾酮，加入干燥丙酮30 mL(相对密度0.784 5 g/mL，约0.416 mol)，搅拌下加入磷钼酸10 mg(约0.045 1 mmol)，反应物在室温条件下不断搅拌，每隔10 min 取样1 次，用薄层层析板检测反应进程。待用薄层层析检测，显示不出β－蜕皮甾酮的特定条带时，在反应液中加入0.12 mol/L的碳酸氢钠溶液终止反应，混合液用氯仿萃取3 次，有机相经饱和食盐水洗并收集有机相，将得到的有机相再经过水洗后用无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸出溶剂。

1.2.2 20 － ECD 20，22 － diacetonide 和20 － ECD 2，3 － diacetonide 的合成方法 将110 mg(0.208 mmol)β－蜕皮甾酮溶解在1.0 mL 的甲醇中，再加入干燥丙酮30 mL 和对甲基苯磺酸钠吡啶盐10 mg，混合物在室温条件下不断搅拌，每隔10 min 取样1 次，用薄层层析板检测反应进程。待在薄层层析板上检测到香草醛显色条带数量不再增加并且β －蜕皮甾酮特征条带不再发生变化时，向反应液中加入水20 mL 终止反应，用氯仿萃取3 次，再将有机相经水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥过夜后，减压蒸出溶剂。

1.3 分离方法

1.3.1 流动相的检测 参照相关文献［4，7］将石油醚、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等5 种化合物，按一定比例配制成16 种展开剂(详细配比见表1)，从中优化出β －蜕皮甾酮类物质的最适展开剂:将分别用磷钼酸和对甲基苯磺酸钠吡啶盐脱水剂脱水得到的两种反应产物的浓缩液分别用Linomat 5 自动点样，薄层层析板的规格为10 cm×10 cm，点样量为5 μL，将点好样的薄层层析板分别放入不同比例的展开剂中展开，待溶剂前沿至95 mm，取出晾干，l%香草醛－浓流酸溶液显色，105 ℃烘3 min，拍照保存，同时根据Rf 值优化展开剂。

1.3.2 硅胶柱层析 硅胶在烘箱中活化2 h，干燥器中冷却到室温，用流动相充分浸泡，超声脱气，重力沉降法装柱，用流动相洗出硅胶中的杂质并平衡，将分别用磷钼酸和对甲基苯磺酸钠吡啶盐脱水剂脱水得到的两种浓缩液分别加入到已经平衡好的硅胶柱中，在不同比例的流动相中展开，用薄层层析板跟踪流出液的成分，将在薄层层析板上同一位置上显示单一斑点的流出液合并，旋转蒸发仪蒸出溶剂，真空干燥器中干燥浓缩液，得到纯白色的固体物质。

表1 展开剂组分及比例Tab.1 Composition and proportion of mobile phase

1.4 结构检测

利用1HNMR 和MS 表征物质结构:1HNMR 在BrukerARX －300 型核磁共振分析仪测定，以CDCl3为溶剂，TMS 为内标，样品浓度:约25 mg/mL，温度20 ～25 ℃，1HNRM 的观察频率分别为300 MHz。

2 研究结果

2.1 薄层层析

用磷钼酸作为β－蜕皮甾酮异丙叉化反应的催化剂时，反应终止的反应液经过薄层层析板显色可显示两条条带，其中展开距离最短的为没有参与反应的β －蜕皮甾酮，用氯仿:甲醇(1∶8)作洗脱剂洗脱、收集留样并干燥后可以获得20 －ECD 2，3∶20，22 －diacetonide 纯品(得率约为50.51% ±0.50%)，而用对甲基苯磺酸钠吡啶盐做为β－蜕皮甾酮的异丙叉化反应的催化剂，通过检测反应进程，发现当反应进行1 h 后，反应液在薄层层析板上可以显示4 条带，其中展开距离最短的为没有反应的β －蜕皮甾酮，用氯仿:甲醇(8∶1)作为洗脱剂洗脱、收集留样并干燥后可以获得白色的20 －ECD 2，3∶20，22 －diacetonide 纯品(得率约为24.35% ±0.50%);用氯仿:甲醇(4∶1)作为洗脱剂洗脱、收集留样并干燥后可以获得纯白色的20 －ECD 20，22 －diacetonide 纯品(得率约为31.26% ±0.50%);用氯仿:甲醇(2∶1)作为洗脱剂洗脱、收集留样并干燥后可以获得纯白的20－ECD 2，3－diacetonide 的纯品(得率约为32.49% ±0.50%)，由此可见，通过适当的控制反应进程，以甲基苯磺酸钠吡啶盐作为β －蜕皮甾酮异丙叉化反应的催化剂可以同时获得β－蜕皮甾酮的3 种关键性的异丙叉化合物，这3 种环氧化合物可以作为合成其它种蜕皮甾酮衍生物的前导化合物。此外，这3 种前导化合物也是进行蜕皮甾酮类衍生物化学合成的必经路径，因此本实验重点研究这3 种前导化合物的合成方法及分离技术，从中优化出既可以减少物料的损失又可以减少操作步骤，并且适用于工业生产的工艺方法。

表2 甾酮类物质在16 种展开剂中展开时的Rf 值Tab.2 Rf value of sterone analogues among 16 developing solvent

2.2 甾酮类物质在16 种展开剂中展开时的Rf 值

如表2 所示:在石油醚和丙酮、乙酸乙酯和丙酮作为展开剂，展开蜕皮甾酮类物质，展开效果差;以乙酸乙酯、甲醇作为展开剂展开4 种物质时，Rf 的值都介于0.1 ～0.8，4 种物质间Rf 值的差值介于0.09～0.13，有分离现象，但是Rf 值比较接近，不易将4 种物质完全分离开，当用乙酸乙酯和甲醇作为洗脱剂洗脱时，20 －ECD 20，22 －diacetonide 和20 －ECD 2，3∶20，22 －diacetonide 同时被洗脱下来;以氯仿和甲醇作为展开剂时4 种物质间Rf 值的差值比较大且差值介于0.16 ～0.37，分离效果较好，优化得出以氯仿:甲醇(8∶1)作为流动相洗脱时可分离得到20 －ECD 2，3∶20，22 －diacetonide，以氯仿:甲醇(4∶1)作为流动洗脱开可分离得到20 －ECD 20，22 －diacetonide，以氯仿:甲醇(2∶1)作为流动洗脱可分离得到20 －ECD 2，3 －diacetonide。

2.3 利用MS、1HNMR 对分离得到的物质结构表征结果

对照组(20-ECD)的数据显示:HR －ESI －MS(m/z)∶503.8［M +Na］+，表明其分子量为480，同时20-ECD 从表3 可看出，1HNMR 谱中出现甾醇类物质特有峰值信号，证实表征蜕皮激素衍生物结构的验证体系可以应用。20 －ECD 2，3∶20，22－diacetonide:HR－ESI－MS(m/z)∶583.30［M+Na］+，表明其分子量为560，20 －ECD 2，3∶20，22 －diacetonide 的1HNMR 谱与20 －ECD 的1HNMR 谱相比较，不但出现甾醇类物质特有的峰值，而且还出现了4 个峰值为 δ:1．33、1．42、1．33、1．50 的特殊峰，这4 个峰值范围中 －CH3基团的峰值范围，因此可以证实该物质为:20 －ECD 2，3∶20，22 －diacetonide;20－ECD 20，22 －diacetonide HR－ESI－MS(m/z)∶543．98［M+Na］+，表明其分子量为517，20 －ECD 20，22 －diacetonide 的1HNMR 谱与20 －ECD 的1HNMR 谱相比较，δ 值在0．7 ～1．6 有7 个峰，其中5 个峰值为－CH3基团峰值范围内，其他两个峰值，为一个基团中两个－CH3的峰值，此外将20 －ECD 20，22 －diacetonide 的1HNMR 谱与2 －ECD 2，3∶20，22 －diacetonide 的1HNMR 谱相比较，在 δ 值为3．63 处出现一个峰值，δ 值出现位移，由3．93 变为3．63，由此证实22 位结构发生环氧化反应;20 －ECD 2，3 －diacetonide:HR－ESI－MS(m/z)∶543．64［M+Na］+，表明其分子量为517。20 －ECD 2，3 －diacetonide 的1HNMR 谱与20 －ECD 的1HNMR 谱相比较，在 δ 值为3．88 和3．93 处，都出现一个峰值，且位移差距小，证实在22 位没有发生结构变化，而在δ 值为1．38 和1．57 处出现两个峰，这两个峰值归属的峰值特征，由此可以确定在β －蜕皮甾酮的2、3 位引入基团，证实其该物质的结构应该为20 －ECD 2，3 －diacetonide。

3 讨论

磷钼酸作为脱水剂只能合成一种β－蜕皮甾酮的环氧产物即2，3∶20，22 －diacetonide。相比较，本文尝试用对甲基苯磺酸钠吡啶盐作为β－蜕皮甾酮的异丙叉化反应催化剂，通过实时控制反应进程，可以同时获得β－蜕皮甾酮的3 种关键性的异丙叉化合物，即可以减少物料的损失又可以大大减少操作步骤。

闰竟宇等［3］的研究表明可以采用丙酮、乙酸乙酯作为展开剂，分离结果可行。但在本实验中通过展开剂的优化，发现石油醚和丙酮、乙酸乙酯和丙酮展开剂的极性小，很难分离甾酮类物质;而乙酸乙酯和甲醇在分离这3 种环氧化合物时，各物质的Rf 值很接近，分离效果与氯仿和甲醇混合液相比不是很理想;并最终确定氯仿和甲醇为分离甾酮类物质的最佳流动相。

蜕皮甾酮结构复杂，反应需要在温和的条件下进行，本研究曾试图利用强酸做脱水剂，结果失败，与强酸反应蜕皮甾酮的结构将很快分解。且在试验过程中所用到的试剂必须经过干燥处理，试剂干燥是影响试验结果的关键因素。

通过对蜕皮甾酮衍生物合成过程中的关键中间体的合成过程和分离过程的优化，获得一种高效、简单、经济的合成蜕皮甾酮衍生物中间体的合成、分离技术及纯化的方法。通过化学修饰提高蜕皮甾酮衍生物活性的是一个不断突破和改进的过程，因此利用化学修饰的手段获得高活性蜕皮甾酮衍生物还有很大的研究空间。本文重在尝试寻找在β－蜕皮甾酮分子结构中4 个邻位羟基环氧化处理的同时为进一步获得更多活性的蜕皮甾酮衍生物奠定基础。

［1］胥秀英，郑一敏，王龙.植物蜕皮激素的研究进展［J］.生物学杂志，2005，22(2):12 －14.

［2］迟德富，苗建才.昆虫生长调节剂及应用技术［M］.哈尔滨:黑龙江省科学技术出版社，2005.

［3］闰竟宇，李铣，程卯生.β－蜕皮甾酮的分离制备及其结构修饰［D］.沈阳:沈阳药科大学，2005.

［4］吕应年，邓亦峰，李彩虹，等.常压硅胶柱层析分离制备高纯贝壳杉烷型二萜［J］.化学与生物工程，2006，23(9):60－62.

［5］王丽丽，王坤波一，黄建安，等.茶叶中儿茶素薄层色谱分离所用展开剂的优化［J］.湖南农业大学学报:自然科学版，2012，38(1):102 －105.

［6］王秋红，杨柳，姜海，等.怀牛膝中甾酮类成分的分离与鉴定［J］.中医药学报，2012，40(1):69 －71.

［7］王强，俞祥生.19 种资源植物中β－蜕皮激素的含量测定［J］.中国医药大学学报，2009，21(3):229 －231.

［8］Suksamrarn A，Pattanaprateep P，Selective acetylation of 20 － hydroxyecdysone partial synthesis of some minor ecdysteroids and analogues［J］，Terahedron，1995，51(38):10633 －10650.

［9］Odinokov V N，Galyautdinow I V.Transformation of 20 － hydroxyecdysone acetonides into podecdysone B［J］.Russian Journal of Organic Chemistry，2003，39(7):952 －956.

［10］Suksamrarn A，Pattanaprateep P，Tanachatchairatana T，et al.Chemical modifications at the 22 － hydroxy group of ecdysteroids alternative structural requirements for high moulting activity［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2002，32:193 －197.