GC-MS/MS测定面包和饼干中富马酸二甲酯的研究

江 丰，汪志慧，朱晓玲，严 恒，黄 茜，曹 晖

（1.湖北省商品质量监督检验研究中心，湖北武汉 430010；2.武汉生物工程学院，湖北武汉 430415）

富马酸二甲酯（Dimethyl fumarate，DMF），是美国20世纪80年代开发出来的一种新型防腐剂。由于DMF具有毒性低、抑菌能力强、抑菌种类多、不受环境影响等特点，在我国被广泛应用于食品、粮食、饲料等的防腐、防霉及保鲜[1-2]。DMF易水解生成甲醇，长期食用对肝、肾有很大的副作用，对人体尤其是儿童的成长发育危害很大[3]。我国卫生部在2009年2月6日公布的食品中可能违法添加的非食用物质名单中明确规定DMF不允许在食品中使用，但一些不法经营者仍违法将DMF用于食品的防腐[4]。目前卫生部公布的DMF的检测方法的检测限高达25mg/kg，远不能满足欧盟对产品中DMF的含量不应超过0.1mg/kg的要求[5]，因此建立一种准确、检出限低的DMF的测定方法非常必要。目前DMF的检测方法有薄层法[6]、液相色谱法[7-9]、气相色谱法[10-12]、气相色谱-质谱法[13-14]和气相色谱-质谱-质谱法[15-16]法，但将超声波辅助提取和气相色谱-三重串联四级杆质谱相结合检测面包和饼干食品中DMF的方法未见报道。本文拟建立一种检测限低、精密度好、回收率高的气相色谱-串联三重四级杆质谱法来测定面包和饼干中DMF，为面包和饼干中DMF的检测方法提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

富马酸二甲酯标准品 SIGMA公司；丙酮、乙腈、三氯甲烷、乙酸乙酯 均为分析纯；C18SPE小柱 安捷伦科技有限公司。

气相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪TSQ Quantum XLS 赛默飞世尔科技；超声洗涤仪 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 标准溶液的配制

准确称取0.10g富马酸二甲酯标准品，用乙酸乙酯溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，配制成1.00mg/mL的标准储备液。然后以乙酸乙酯逐级稀释成0.001、0.005、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00μg/mL标准工作系列。

1.3 样品处理

称取2.00g粉碎样品于10mL具塞试管中，加入10mL乙酸乙酯，超声波提取25min，静止10min后，将上清液用装有无水硫酸钠的漏斗过滤至烧杯中，将滤液完全转移至已用乙酸乙酯预淋过的C18SPE小柱中，再用5mL乙酸乙酯分两次淋洗小柱，合并淋洗液，浓缩并定容至10mL，用GC-MS/MS分析。

1.4 仪器条件

色谱柱：TR-5 MS毛细管气相色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）；柱温箱：70℃保持1min，以10℃/min的升温速率升至150℃，再以25℃/min的升温速率升至200℃，保持4min；进样口温度：220℃；进样方式：不分流进样；载气流速：1.2mL/min；传输线温度：230℃；进样量：1μL；离子源：EI源；离子源温度：230℃；扫描模式：选择反应监测模式（SRM）；扫描时间：4～6min；碰撞气压力：1.0mTorr；循环时间：0.3min。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

图1 DMF总离子流色谱图（0.050μg/mL）Fig.1 Total ion chromatogram of DMFstandard sample（0.050μg/mL）

图2 DMF标样的一级质谱图（0.050μg/mL）Fig.2 The mass spectrum of standard DMF solution（0.050μg/mL）

2.1.1 富马酸二甲酯的定性分析 通过全扫描方式观察总离子流图，得到目标化合物的分子离子峰，在本方法的分析条件下，测得DMF特征色谱峰的保留时间为5.09min（见图1）。对该色谱峰分析得到一级质谱图（见图2），出现的特征性质谱峰有：m/z59、85、113。与数据库中DMF的质谱图基本吻合。

2.1.2 碰撞能量的优化和特征离子的选择 DMF在EI电离条件下，选定丰度值最大的m/z113碎片离子作为母离子，通过碰撞反应进行离子扫描，逐步加大碰撞能量，母离子丰度逐渐减少，子离子丰度逐渐增加。选用丰度较大的两个离子m/z85、59分别作为定量和辅助定性离子（见图3），并确定最佳碰撞能量的范围，最后在SRM模式下进一步调整碰撞能量，以获得DMF的最大灵敏度。最终选择的母离子、子离子和碰撞能量详见表1。

图3 DMF溶液的二级质谱图（0.050μg/mL）Fig.3 The second step mass spectrum of standard DMF solution（0.050μg/mL）

表1 检测DMF的质谱条件Table 1 Mass spectrum conditions for the detection DMF

2.2 提取条件的优化

图4 提取溶剂对回收率的影响（n=3）Fig.4 Effect of different solvents on the recovery rate（n=3）

2.2.1 提取溶剂的选择 文献[17]报道，丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈溶液均可作为面包和饼干中DMF的提取溶剂。为了进一步提高面包和饼干中DMF的回收率，在实验过程了分别用丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈溶液对含0.020μg/mL DMF的饼干样品进行提取，实验结果如图4所示。从图4中可知，三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈的回收率均较高，但从经济性、毒性等方面综合考虑，最终选择乙酸乙酯作为提取溶剂。另外，由于样液中含有一定量的油脂，所以有必要对样品进行净化处理。本实验采用C18SPE小柱对油脂进行吸附，回收结果表明，利用C18SPE小柱净化样品可以在保证回收率的同时减少油脂对色谱柱的污染损坏。

2.2.2 超声提取时间的选择 用10mL乙酸乙酯溶液对含0.020μg/mL DMF的饼干样品进行不同时间的超声提取，从图5可以看出，随着时间的延长，回收率逐渐上升，25min后基本达到平稳。这是因为DMF的扩散需要一定的时间，适当延长超声波提取时间，能使溶剂分布均匀；另外，提取过程中超声波会产生一定的热量[18]，这都将有利于回收率提高，但温度过高会导致乙酸乙酯挥发，造成定量不准确，综合考虑以上因素，最终选择的超声提取时间为25min。

图5 超声提取时间对回收率的影响（n=3）Fig.5 Effect of ultrasound extracting time on the recovery rate（n=3）

2.3 方法学验证

2.3.1 重现性 在上述优化条件下，分别将质量浓度为0.005、0.010、0.050μg/mL的DMF标准溶液连续进样6次，峰面积的相对标准偏差（RSD）范围分别为2.77%、1.11%和2.13%，结果表明，方法的重现性良好，能满足检测的要求。

2.3.2 方法的线性范围 用乙酸乙酯配制DMF质量浓度为0.001～1.00μg/mL的标准工作液，分别进行测定。以峰面积y对相应的质量浓度x（μg/mL）进行线性回归，得到线性方程y=8.42134×106x+19364.4，其相关系数R2=0.9999，呈现很好的线性关系，且线性范围广。

以信噪比S/N=3时所对应的DMF质量浓度作为仪器检测限，计算得到仪器检测限为0.0005μg/mL；以取量2.0g计，本方法的检出限为0.0025mg/kg。以10倍信噪比的方法计算本方法定量限为0.0075mg/kg，其值远低于卫生部公布的DMF的检测方法的检测限（25mg/kg）。

2.3.3 实际样品分析和回收率实验 分别在空白样品中加入不同量的DMF，混匀，按前述方法处理样品，用GC-MS/MS测定，分别计算回收率及其相对标准偏差。由表2可见，方法的回收率为84.7%～99.8%，相对标准偏差为1.46%～3.61%。加标样品和面包样品的二级总离子流色谱图分别为图6和图7。

表2 DMF加标回收率实验（n=3）Table 2 Spike recovery test of DMF（n=3）

图6 DMF加标样品的二级总离子流色谱图（0.05mg/kg）Fig.6 The second step complete total ion chromatogram of DMF add standard sample（0.05mg/kg）

图7 面包样品的二级总离子流色谱图Fig.7 The second step complete total ion chromatogram of bread

3 结论

本研究建立的测定面包和饼干中DMF含量的方法，采用了气相色谱-三重串联四级杆质谱的选择反应监测（SRM）模式，经碰撞能量优化实验，确定特征离子，获得了极高的检测灵敏度；同时分析了提取溶剂和超声波提取时间对回收率的影响，最终确定提取溶剂为乙酸乙酯，超声波提取时间为25min。经过方法学验证和实际样品分析，相关线性、回收率及相对标准偏差均能取得很好的效果。本方法定量限为0.0075mg/kg，远低于卫生部公布的DMF的检测方法的检测限（25mg/kg）。因此，本方法具有准确、回收率高、检出限低等优势，在定性和定量分析方面都能满足面包和饼干中DMF的分析要求。

[1]李鹏，耿健强，李伟，等.气相色谱法测定食品中富马酸二甲酯[J].食品研究与开发，2011，32（3）：136-138.

[2]朱恩俊，孙健，王举兵，等.富马酸二甲酯对贮藏期间毛叶枣品质的影响[J].食品工业科技，2011，32（5）：363-366.

[3]郑晓冰，赵质创，肖晓槟.高效液相色谱法测定食品中的富马酸二甲酯[J].化学分析计量，2011，20（3）：23-25.

[4]张英，郑志伟，黄碧兰.气相色谱法测定腊肉制品中富马酸二甲酯[J].中国卫生检验杂志，2010，20（7）：1600-1605.

[5]Riccardo Narizzano， Fulvia Risso， Gloria Venturelli， et al.Gas-chromatography-mass spectrometry analysis of dimethyl fumarate in consumer products[J].Journal of Chromatography A，2009，1216（39）：6762-6766.

[6]张杨，陈伟强.薄层法检测富马酸二甲酯方法探讨[J].中国卫生检验杂志，2001，11（6）：722.

[7]刘义，朱显琴，邱宏，等.高效液相色谱法同时测定食品中的糖精钠，苯甲酸，山梨酸，富马酸二甲酯和脱氢乙酸钠[J].中国卫生检验杂志，2009（3）：582-583.

[8]周建科，杨冬霞，徐鹏，等.固相分散萃取-液相色谱法测定豆沙中的富马酸二甲酯[J].食品工程，2010（3）：57-59.

[9]庞艳苹，赵志磊，吴广臣，等.高效液相色谱法测定面制品中富马酸二甲酯的含量[J].食品工业科技，2009，30（6）：311.

[10]刘文静，赵小珍，张松.糕点中富马酸二甲酯的毛细管气相色谱快速测定[J].分析测试技术与仪器，2010，16（1）：32-35.

[11]周慧敏，赵彤，姜俊，等.食品中富马酸二甲酯残留量的测定-气相色谱法[J].光谱实验室，2011，28（2）：689-692.

[12]Lamas J P，Sanchez Prado L，Garcia Jares C，et al.Determination of dimethyl fumarate in desiccant and mouldproof agents using ultrasound-assisted extraction gas chromatography with electron-capture detection[J].Journal of Chromatography A，2009，1216（30）：5755-5758.

[13]阚周密，林建阳，王戏丹.气相色谱-质谱联用法测定食品中富马酸二甲酯的含量[J].食品科学，2007，28（1）：247-249.

[14]Stefanelli P，Barbini DA，Girolimetti S，et al.Determination of dimethyl fumarate（DMFu） in silica gel pouches using gas chromatography coupled ion trap mass spectrometry[J].Journal of Environmental Science and Health Part B，2011，46（4）：341-349.

[15]李东刚，李春娟，刘晓玲，等.三重四级杆气质联用法分析小麦粉制品中富马酸二甲酯[J].分析实验室，2009，28（12）：109-111.

[16]张清智，孙忠松，王境堂，等.气相色谱-串联质谱法测定食品中的富马酸二甲酯[J].食品科学，2010，31（20）：314-317.

[17]张英，郑志伟，黄碧兰.气相色谱法测定腊肉制品中富马酸二甲酯[J].中国卫生检验杂志，2010，20（7）：1600-1605.

[18]黄群，麻成金，马美湖，等.超声波辅助提取鹌鹑蛋黄卵磷脂研究[J].食品科学，2006，27（11）：297-300.