动物组织中呋喃妥因代谢物残留酶联免疫试剂盒的研制

罗晓琴，方华林，张德红，孙 震，赵正苗，崔廷婷

（1.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206；2.遵义县苟江镇农业服务中心，贵州遵义563101）

硝基呋喃类药物是人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，主要包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮[1]，常作为抗生素用于预防和治疗由沙门氏菌和埃希氏菌引起的猪、牛、家禽及蜜蜂的胃肠道疾病[2]。但近年来的研究表明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有很大的毒性，有致畸胎副作用，且能诱发癌症，因而引起了人们的高度重视，多国已禁止了此类药物在治疗和饲料中的使用[3]。由于硝基呋喃类药物的热和化学不稳定性，常以检测其代谢产物作为残留标示物[4]。目前用来检测呋喃妥因代谢物的最常用方法是高效液相色谱法[5-6]、液质联用法[3，7-8]等，由于复杂的仪器设备和繁琐的前处理过程以及对检验人员的高技能要求，不适合现场监控和大量样本的筛查。因此，本文的目的是建立一种快速、灵敏地检测动物组织中呋喃妥因代谢物残留的酶联免疫吸附方法（ELISA）。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雌性Balb/c小鼠 6～8周龄，清洁级，由北京勤邦生物技术有限公司实验动物室提供；呋喃妥因代谢物（AHD）、二甲基甲酰胺、对苯二甲醛、2-硝基苯甲醛、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA） 美国Sigma公司；其他常规化学试剂 分析纯，购自北京化学试剂公司；衍生化试剂 将15.1mg 2-硝基苯甲醛溶解于10mL甲醇中。

匀浆机8010S 上海斯伯明仪器设备有限公司；电子天平2000SBL 美国Setra公司；振荡器KS-Ⅱ 上海跃进医疗器械厂；漩涡混合器QL-901 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；低速离心机Anke TDL-40B 上海安亭科学仪器有限公司；氮吹仪DSY-Ⅲ北京金科精华苑科技有限公司；微量移液器 单道20～200μL、100～1000μL，多道20～300μL，美国Thermo公司；生化培养箱DHP-600 天津市中环实验电炉有限公司；酶标仪MK3 美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 半抗原的合成 称取1.15g AHD溶于20mL二甲基甲酰胺（DMF）中，得到A液；取5.36g对苯二甲醛溶于100mL DMF中，得到B液；室温下将A液缓慢滴加入B液中，滴加完毕后室温至60℃反应2～4h，除去溶剂，柱层析纯化，得到淡黄色物质，即为呋喃妥因代谢物半抗原。

1.2.2 人工抗原的制备 免疫原的制备过程：取12mg AHD半抗原溶于1mL DMF中，得到溶液I；取40mg BSA溶于6mL水中，得到溶液Ⅱ；将溶液I滴加入溶液Ⅱ中，室温反应24h，得到溶液Ⅲ；取NaBH414mg用0.2mL 0.1mol/L NaOH溶解后加入溶液Ⅲ中，4℃反应2h；用0.01mol/L磷酸缓冲液4℃透析3d，每天换液3次，以除去未反应的小分子物质，得到呋喃妥因代谢物免疫原；分装，于-20℃保存备用。

包被原的制备过程：取10mg AHD半抗原溶于1mL DMF中，取36mg OVA溶于7mL水中，其余步骤同免疫原的制备。

1.2.3 单克隆抗体的制备 按照常规方法免疫Balb/c小鼠制备腹水抗体，用饱和硫酸铵法纯化后备用[9]。

1.2.4 抗抗体工作液的制备 以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体后，将其与辣根过氧化物酶（HRP）采用过碘酸钠法[9]进行偶联得到酶标二抗。

1.2.5 包被抗原与抗体最佳工作浓度的确定 采用方阵滴定法，对包被抗原和抗体工作液的稀释度进行筛选并确定，最终以零标准品OD值为1.5～2.0，0.05μg/L标准品抑制率为70%～80%时的浓度作为最佳工作浓度[10-11]。

1.2.6 酶标板的制备 用包被缓冲液将包被原（AHD半抗原-卵清蛋白偶联物）稀释成0.2μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育2h，倾去包被液，洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

1.2.7 酶联免疫检测方法的建立 向包被有呋喃妥因代谢物偶联抗原的酶标板微孔中加入标准品溶液或样品溶液50μL/孔，再加入单克隆抗体工作液与酶标二抗的混合液（预先将两者按10∶1体积比混合并混匀）50μL/孔，用盖板膜盖板，4℃恒温箱中反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作洗板5次，用吸水纸拍干；然后加入底物显色液A液和B液各50μL/孔，轻轻振荡混匀，25℃恒温避光显色15min后，加入2mol/L终止液硫酸50μL/孔，轻轻振荡混匀，将酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值（OD值）。

1.2.8 试剂盒标准曲线的建立 按式（1）计算百分吸光率。

式中，A为标准品或样品溶液的吸光度；A0为空白（浓度为0μg/L标准溶液）的吸光度。以呋喃妥因代谢物标准品浓度的对数值为X轴，百分吸光率为Y轴，绘制标准曲线。

1.2.9 样品前处理方法的建立 用均质器均质样本后，取（1.0±0.05）g的均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入4mL去离子水、0.5mL 1mol/L盐酸溶液和100μL衍生化试剂，用振荡器充分振荡2min，37℃过夜孵育（大约16h）；加入5mL 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液、0.4mL 1mol/L氢氧化钠溶液和5mL乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s，4000r/min，室温（20～25℃）离心10min；取2.5mL上层有机相至10mL干燥玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1mL的正己烷用涡旋仪涡动1min，再加入1mL复溶工作液，用涡旋仪涡动30s充分混匀后转入2mL聚苯乙烯离心管中，4000r/min，室温（20～25℃）离心5min；除去上层有机相，取下层水相50μL用于分析。

1.2.10 试剂盒各项技术参数的确定

1.2.1 0.1 检测限实验 取空白鸡肉、猪肉、猪肝、虾样本各20份进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光率的浓度，以20份样本的浓度平均值（X）和标准差（S）表示检测限（MDL），即MDL=X+3S。

1.2.1 0.2 精密度和准确度实验 以0.2、0.4、0.8μg/kg三个浓度的呋喃妥因代谢物标准品分别对空白鸡肉、猪肉、猪肝、虾样品进行添加回收实验，计算回收率和变异系数。

1.2.1 0.3 特异性实验 试剂盒的特异性用交叉反应率表示。按式（2）计算交叉反应率：

其中，X为引起50%抑制的呋喃妥因代谢物浓度；Y为引起50%抑制的类似物浓度。

1.2.1 0.4 稳定性实验 将足量的试剂盒保存于2～8℃环境中，每隔1个月取出适量，分别测定其零标准品的OD值、IC50，及0.2、0.4、0.8μg/kg添加的鸡肉、猪肉、猪肝、虾样本的回收率，根据实验结果判断试剂盒的稳定性。

1.2.1 0.5 有效性的验证 随机抽取鸡肉、猪肉、猪肝、虾盲样各20份，用本试剂盒方法与标准方法《GB/T 20752-2006猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（检测限为0.5μg/kg）[12]分别对其进行检测，根据实验结果验证试剂盒检测实际样本的有效性。

2 结果与分析

2.1 包被抗原与抗体的最佳工作浓度

通过方阵法实验筛选得到：包被抗原的最佳工作浓度为1∶5000，抗体的最佳工作浓度为1∶（1.5×105）。

2.2 标准曲线的建立

按照1.2.7的步骤，分别测定浓度为0、0.05、0.1、0.3、0.6、1.2μg/L呋喃妥因代谢物标准品的吸光度，采用RIDASCREEN数据分析软件建立标准曲线，如图1所示，其中IC50值为0.094μg/L。

图1 呋喃妥因代谢物的标准曲线Fig.1 Standard curve of AHD

2.3 检测限

根据MDL=X+3S，得该方法对鸡肉、猪肉、猪肝、虾样本的检测限均为0.1μg/kg。

2.4 精密度和准确度

ELISA测定的精密度以变异系数表示，准确度以回收率表示。取空白鸡肉、猪肉、猪肝、虾样本，以0.2、0.4、0.8μg/kg三个浓度的呋喃妥因代谢物对其进行添加回收实验，结果见表1。

表1 试剂盒的精密度和准确度Table 1 Precision and accuracy test of the ELISA kit

由表1可知，以0.2、0.4、0.8μg/kg三个浓度水平的呋喃妥因代谢物对空白鸡肉、猪肉、猪肝、虾样本进行添加，其加标平均回收率范围为78.2%～102.7%，变异系数为5.1%～11.4%，数据结果显示试剂盒重复性较好。

2.5 特异性

结果表明，该试剂盒与呋喃妥因原药有一定的交叉反应，为13%，这可能是因为呋喃妥因代谢物与其原药有类似的结构，而对其他呋喃类药物及代谢物的交叉反应率均较低（＜1%），表明本试剂盒具有良好的特异性，结果见表2。

表2 试剂盒特异性实验Table 2 Cross-reactivity test of the ELISA kit

2.6 稳定性

结果显示，试剂盒从生产之日起至第12个月，零标准品的OD值，IC50及0.2、0.4、0.8μg/kg添加的鸡肉、猪肉、猪肝、虾样本的回收率均达到所确定的技术参数要求；随后回收率下降至50%以下，灵敏度降低。可见，试剂盒稳定性较好，可在2～8℃至少保存12个月。

2.7 有效性的验证

通过试剂盒方法和仪器方法对随机抽取的鸡肉、猪肉、猪肝、虾样本进行测定，结果筛选出6份阳性样本（含量大于0.5μg/kg），其中鸡肉2份、猪肝3份、虾1份，比较结果见表3。

由表3可知，以0.5μg/kg作为阳性判定线，LCMS/MS法对以上样本的检测结果均为阳性；ELISA法对以上样本的检测结果也为阳性，且检测时间短（45min），用ELISA法和LC-MS/MS法的测定结果基本一致，因此ELISA方法适用于动物组织中呋喃妥因代谢物残留的快速筛选。

3 结论

呋喃妥因作为一种硝基呋喃类药物，因具有较大的毒性和致癌致畸的可能性，已禁止在治疗和饲料中使用。但我国仍有大量养殖户使用该药物，因此建立一种敏感度高、操作简单、成本低、适合大规模推广的检测方法是非常必要的。酶联免疫方法采用特异性抗体，具有较高的精确度和灵敏度、较低的操作技术要求和短暂的检测时间、检测样本量大等特点，但目前国内外有关呋喃妥因代谢物酶联免疫检测的研究报道较少。

本研究成功制备出呋喃妥因代谢物单克隆抗体，初步建立了呋喃妥因代谢物酶联免疫试剂盒检测方法，该方法的IC50值为0.094μg/L，最低检测限为0.1μg/kg，样本加标回收率范围为78.2%～102.7%，变异系数为5.1%～11.4%，并且检测时间短（45min），样本前处理简单、仪器设备投资少，检测成本低，适合于大量样本中呋喃妥因代谢物残留量检测的快速筛选，能够更好地满足我国畜禽养殖户、屠宰场、食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

表3 ELISA法和LC-MS/MS法检测结果比较Table 3 Comparison determination results of ELISA with LC-MS/MS

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