高效液相色谱法快速测定紫贻贝中的牛磺酸

张 亮，刘 文，郑平安，黄 健，李 晔，张春丹，苏秀榕，*

（1.宁波大学海洋学院，浙江宁波 315211；2.北京普析通用仪器有限责任公司，北京101200）

牛磺酸（Taurine），又称β-氨基乙磺酸，是一种非蛋白结构的含硫氨基酸，在鱼贝类尤其是软体动物中含量十分丰富[1]。牛磺酸对人体起十分重要的生理调节功能，在促进中枢神经系统生长发育[2]、提高学习记忆能力[3]及延缓衰老[4]等方面具有重要调节作用，特别是对婴幼儿的生长发育起着至关重要的作用[5-6]。据报道，贝类中马氏珠母贝中牛磺酸含量高达13830mg/kg[7]，牡蛎中牛磺酸含量至少也有8000mg/kg[1]，紫贻贝中牛磺酸含量相对低一些，但也达到4400mg/kg[1]。目前以上三种贝类的市场价格，马氏珠母贝和牡蛎平均价分别为60元/kg和40元/kg，远远高于紫贻贝2元/kg这一低廉的价格。可见，紫贻贝作为一种廉价的牛磺酸来源有其广泛的市场价值。随着牛磺酸研究及应用的迅速发展，牛磺酸定量检测的方法也急待建立和改进。目前牛磺酸的测定方法主要有分光光度计法[8]、薄层层析法[9]、氨基酸自动分析法[10-11]和高效液相色谱法[12-13]等。随着色谱技术的发展，高效液相色谱法因其样品预处理简单，方法准确度、精确度及灵敏度较高，在测定食品和生物组织中牛磺酸含量的应用中日益广泛[14-16]。其中，柱前衍生高效液相色谱法是高效液相色谱法测定牛磺酸比较常用的方法之一[1]，只需在一般的HPLC仪器上使用普通的反相柱子就可以进行牛磺酸的测定。其中，邻苯二甲醛（OPA）作为柱前衍生反应试剂在实际中应用较多[17-19]。而国内目前利用OPA柱前衍生高效液相色谱法测定紫贻贝中牛磺酸则尚未见报道，章超桦等[20]利用氨基酸分析仪分析了翡翠贻贝游离氨基酸的组成及含量。本研究利用OPA柱前衍生—高效液相色谱法测定紫贻贝中的牛磺酸，方法简便、快速，为高效、准确的牛磺酸分析及其方法建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫贻贝（Mytilus edulisLinnaeus） 购于宁波市江北区农贸市场，开壳后取肉，匀浆、分装，置-20℃冷冻备用；甲醇、乙腈 均为色谱纯；牛磺酸标准品美国Sigma公司；硼酸、氢氧化钠、磺基水杨酸 均为分析纯；邻苯二甲醛（OPA）、乙硫醇 均为化学纯；0.4mol/L硼酸钠缓冲液 称取2.48g硼酸和1.41g氢氧化钠，用水定容至100mL；衍生剂 称取0.1g邻苯二甲醛（OPA）用10mL甲醇溶解，加0.1mL乙硫醇，用0.4mol/L硼酸钠缓冲液定容至100mL。

1200型高效液相色谱仪、Agilent Zorbax 300BC18（4.6mm×250mm，5μm）反相色谱柱、G1321A荧光检测器 美国Agilent公司；CQ25-12D超声仪 宁波江南仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 称取紫贻贝3.0g，加10.0mL双蒸水加热煮沸10min，再超声萃取15min，定容至50mL。充分混匀后，样液于4000r/min离心10min，吸取2.0mL上述上清液于4mL离心管中，再加2.0mL 60g/L磺基水杨酸，离心10min，将此时的上清液转移至10mL小烧杯中，滴加1mol/L氢氧化钠调pH至中性，用水定容至25.0mL，待衍生用。

1.2.2 柱前衍生化反应 吸取1.0mL上述定容液于4mL离心管中，再准确加入1.0mL衍生剂摇匀，置暗处反应2min后，经0.45μm微孔滤膜过滤，立即进样20μL，进行HPLC分析，测定其峰面积，所有试样及标准溶液从反应至进样的时间应保持一致，并控制在5min以内。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇+乙腈+水（10∶10∶80，v/v/v）；流速0.8mL/min；进样量：20μL；荧光检测器（FLD）波长：Ex330nm，Em530nm；柱温：30℃。

1.3 定量测定

标准曲线：用0.02mg/mL标准使用液配制成4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/mL的牛磺酸标准溶液，对所得各浓度标准溶液衍生反应后进样20μL进行测定。

采用外标定量。样品中的牛磺酸含量根据标准曲线方程进行计算。

1.4 回收率测定

在同一样品中加入一定量的牛磺酸标准品，进样测定，以考察方法的准确度。

2 结果与分析

2.1 牛磺酸标准曲线绘制

根据不同质量浓度牛磺酸标准溶液的出峰面积，以牛磺酸质量浓度X（μg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线图（见图1）。牛磺酸标准品色谱图如图2所示。

图1 牛磺酸标准曲线Fig.1 Standard curve of taurine

图2 牛磺酸标准溶液色谱图Fig.2 The HPLCchromatogram of taurine standard solution

由图1可知，牛磺酸在4.0～20.0μg/mL范围内峰面积与浓度的线性回归方程为：Y=45.954X+5.862，相关系数R2=0.9998。结果表明，牛磺酸在此质量浓度范围内线性关系良好。由图2可知，牛磺酸的保留时间为6.752min，出峰较快，为快速检测提供了基础。

2.2 回收率测定

同一样品分别加入不同质量浓度的牛磺酸标准溶液进行测定，各加标量平行测定5次，利用差减法求出牛磺酸的回收率（见表1）。结果表明，此方法的平均回收率为98.71%，相对标准偏差RSD=1.57%。

表1 回收率测定结果Table 1 Recovery test of samples

2.3 精密度测定

同一样品重复测定6次，峰面积见表2，所测峰面积平均值为749.134±17.770，RSD为2.37%。

2.4 样品的测定

按1.2.1和1.2.2方法处理样品，三次平行样测定结果及计算值见表3。由换算结果知，OPA柱前衍生高效液相色谱法测得该紫贻贝样品中牛磺酸的平均质量浓度为17.633μg/mL，换算到原料中牛磺酸的平均质量浓度为3673.631mg/kg。

表2 精密度测定结果Table 2 The result of precision test

表3 紫贻贝中牛磺酸含量Table 3 The taurine content of Mytilus edulis Linnaeus

3 讨论与结论

牛磺酸以游离氨基酸的形式普遍存在于水产品的体内组织和浸出液以及煮汁中[21]，化学性质稳定，易溶于热水中[22]。钱爱萍等[23]比较研究了6%磺基水杨酸热水浴提取法、0.02mol/L盐酸提取法、70%乙醇沸水浴提取法三种从海产品中提取牛磺酸的前处理方法，结果显示，用6%磺基水杨酸热水浴法提取牛磺酸测定值最高。高加龙等[24]采用偏磷酸溶液溶解马氏珠母贝肉，并经超声振荡可进一步提取样品中的牛磺酸。本实验中的样品预处理采用热水浴结合超声振荡来提取紫贻贝中的牛磺酸，并选用60g/L磺基水杨酸作为沉淀剂来沉淀提取液中可溶性蛋白，去除蛋白的干扰。从样品的测定结果来看，该样品前处理方法可有效提取紫贻贝样品中的牛磺酸，且操作简单，实验中测得紫贻贝中牛磺酸的含量同已有文献[1]中报道紫贻贝中牛磺酸的含量4400mg/kg较为接近。

使用OPA作为柱前衍生反应试剂的优点在于它与牛磺酸衍生反应所需时间短，然而，由于其与牛磺酸生成的牛磺酸衍生物稳定时间较短，因此准确控制衍生反应时间是测定的关键。控制反应至进样的时间和操作的一致性，可排除衍生物稳定时间短对测定结果的影响。

以甲醇∶乙腈∶水（10∶10∶80，v/v/v）为流动相，在激发波长330nm，发射波长530nm条件下，平均回收率为98.71%，RSD为1.57%。OPA柱前衍生高效液相色谱法可快速测定紫贻贝中的牛磺酸，且只需要简单的预处理就可以衍生上样分析，并且分析时间短，线性好，灵敏度较高。

[1]谭乐义，章超桦，薛长湖，等.牛磺酸的生物活性及其在海洋生物中的分布[J].湛江海洋大学学报，2000（3）：75-79.

[2]李大庆，吴明均，胡晓华，等.牛磺酸研究进展[J].现代生物医学进展，2011（2）：390-392.

[3]宋春梅，窦肇华.牛磺酸与脑发育的研究进展[J].第四军医大学吉林军医学院学报，2002（1）：54-56.

[4]陈文雄，陈文珊，陈达光.牛磺酸与生长发育[J].国外医学，妇幼保健分册，2000（1）：3-6.

[5]苏秀榕，李太武，丁明进.紫贻贝和厚壳贻贝营养成分的研究[J].中国海洋药物，1998（2）：30-32.

[6]李学梅.牛磺酸的生理作用[J].中国公共卫生，1997（7）：55-56.

[7]章超桦，吴红棉，洪鹏志，等.马氏珠母贝肉的营养成分及其游离氨基酸组成[J].水产学报，2000（2）：180-184.

[8]杨涓，康建宏，魏智清，等.分光光度法测定地骨皮中牛磺酸含量[J].氨基酸和生物资源，2006（3）：26-29.

[9]祖如松.食品中牛磺酸的测定方法——薄层层析法[J].中国卫生检验杂志，1998（5）：35.

[10]陈玉珍，漳广远，龚代来，等.食品中牛磺酸测定方法的研究[J].营养学报，1994（4）：406-411.

[11]王洪健，周兴起，冯志强，等.氨基酸自动分析仪测定食品中牛磺酸的方法建立[J].现代食品科技，2012（3）：348-350.

[12]杨素珍，王淑华，于盛茂，等.高效液相色柱前衍生化法测定食品中的牛磺酸[J].食品工业科技，2002（5）：68-69.

[13]张晾，耿越，张静静，等.高效液相色谱法快速测定海产品中牛磺酸[J].食品与药品，2006（4）：56-58.

[14]Zunin P，Evangelisti F.Determination of free amino acids in infant formulas[J].International Dairy Journal，1999，9（9）：653-656.

[15]WANG X，CHI D，SU G，et al.Determination of Taurine in Biological Samples by High-Performance Liquid Chromatography Using 4-Fluoro-7-Nitrobenzofurazan as a Derivatizing Agent[J].Biomedical and Environmental Sciences，2011，24（5）：537-542.

[16]Rao R N，Maurya P K，Shinde D D，et al.Precolumn derivatization followed by liquid chromatographic separation and determination of tramiprosate in rat plasma by fluorescence detector：Application to pharmacokinetics[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，55（2）：282-287.

[17]杨祖英，张平伟.高效液相色谱法测定食品中的牛磺酸[J].卫生研究，1998（3）：49-51.

[18]钱琳琳，王京端.柱前衍生—反相高效液相色谱法测定牡蛎提取物中的牛磺酸[J].中国海洋药物，1999，18（2）：39-41.

[19]方芳，李从亮，郭鹏，等.邻苯二甲醛柱前衍生法测定高牛磺酸的含量[J].医药导报，2009（7）：926-927.

[20]章超桦，洪鹏志，邓尚贵，等.翡翠贻贝肉的食品化学特性及其在海鲜调味料的应用[J].水产学报，2000（3）：267-270.

[21]黄志斌.水产品综合利用工艺学[M].北京：中国农业出版社，1996：187.

[22]龚丽芬，黄慰生，郑志福，等.牛磺酸的生物活性、提取与测定[J].福建化工，2003（1）：26-28.

[23]钱爱萍，颜孙安，余亚白，等.海产品中牛磺酸测定前处理方法探讨[J].中国农学通报，2006（5）：94-97.

[24]高加龙，章超桦，刘书成，等.邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱法测定马氏珠母贝中牛磺酸含量[J].广东海洋大学学报，2007（1）：55-58.