DNA甲基化与骨肉瘤关系的研究进展

流小舟综述，赵建宁，吴苏稼审校

0 引 言

骨肉瘤是常见的多发于青少年的骨恶性肿瘤，临床表现为侵袭型强且易发生转移［1］。虽然保肢手术技术及新辅助化疗已广泛应用于治疗该疾病，但肿瘤的复发、转移率高及化疗耐药的问题依然存在，患者的五年生存率仅为50%～60%［2］。故骨肉瘤的早期诊断、复发与转移的预测以及避免化疗耐药成为解决此问题的关键。骨肉瘤的发生、发展及转移是十分复杂的过程，它是多种遗传学改变参与的结果。除DNA序列改变外，表观遗传学改变也可导致特定基因表达的异常［3］。而作为表观遗传学中一项重要的研究内容，DNA甲基化是导致癌基因激活和抑癌基因失活的主要原因，已逐渐成为骨肉瘤治疗领域研究的热点［4］。

1 DNA甲基化概述

作为唯一可通过不改变DNA一级结构达到基因转录调控目的，并采用共价化学方式作用的表观遗传学修饰，DNA甲基化是指在 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化作用下，将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到特定碱基上的过程，通常发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等［5］。哺乳动物体内的DNA甲基化则主要通过CpG双核苷酸5'-C上的H被甲基基团所取代来实现［6］。通常这种CpG双核苷酸序列在哺乳动物基因组中出现的频率仅为1%，远低于基因组中的其他双核苷酸序列［7］。其分别以甲基化形式分散于DNA中，可称其为甲基化CpG位点;另一种是非甲基化的CpG双核苷酸高度聚集在基因的5'端，其长度为 0.5～3.0 kbp，富含CG序列(60% ～70%)，称为CpG岛。正常情况下，除无活性的印踪基因和女性X-染色体的转录沉默基因中存在完全甲基化的 CpG岛，其余CpG岛均处于非甲基化状态［8-9］。由于只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化，且其富集于基因启动子区域或附近的外显子区，并包含多个转录因子结合位点(可使转录因子沉默)，这些特性可在细胞分裂过程中得到稳定的遗传［10］。因此CpG岛具有调节基因表达和保护DNA位点不受特定限制酶降解的作用，是导致包括骨肉瘤在内的恶性肿瘤发生、发展、转移及复发的一个重要因素［11］。

2 DNA异常甲基化与基因表达

Santini等［12］研究证实启动子区域 CPG岛的异常甲基化是影响基因转录和表达的重要机制之一。其可能作用机制为:①CpG岛异常甲基化后直接作用于转录因子激活蛋白2基因Ap-2、癌基因c-Myc/Myn、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白CREB、核转录因子NF-κB等在启动子区上结合的位点，阻止了它们的正常识别和始动转录过程［13］。②CpG岛异常甲基化后使启动子区上的位点与特定的转录抑制蛋白甲基胞嘧啶结合蛋白1和2(MeCP-1、MeCP-2)、共同抑制复合物Sin3和甲基化CpG结合域MBD等相结合，间接阻止了转录因子与基因形成转录复合物［14-15］。③CpG岛异常甲基化后通过位点与转录抑制蛋白结合过程，提高组蛋白去乙酞化酶的活性，进而使组蛋白与DNA结合的能力增强，在引起染色质重构的同时阻止转录因子进入启动子区域［16-17］。另外，CPG岛的异常甲基化也可通过直接诱导基因突变从而对基因的表达产生影响［18］。其中在DNMT的作用下封闭尿嘧啶的修复及诱发胞嘧啶向胸腺嘧啶突变是实现基因突变的主要途径［19］。

3 DNA甲基化与骨肉瘤

由于启动子区域CPG岛的异常甲基化使其自卫效应减弱，同时调控DNMT复合体机制发生障碍使其表达量激增。故在恶性肿瘤发生、发展、转移及复发过程中，肿瘤中启动子区域甲基化可导致癌基因、转移正相关基因去甲基化或低甲基化及抑癌基因的高甲基化［20］。

3.1 肿瘤相关基因甲基化与骨肉瘤诊断、预后目前已证实多种基因的甲基化与骨肉瘤的分期、分级、转移及预后等临床指标密切相关［21］。对于这些基因的异常甲基化检测能否为骨肉瘤的早期诊断和预后判断提供参考还在进一步的深入研究中。

3.1.1 RASSF1A基因 作为一种新型肿瘤抑癌基因，RASSF1A基因定位于人第3号染色体短臂上，在细胞凋亡信号的转导、调节细胞周期、控制基因转录及抑制肿瘤发生等方面发挥重要作用。故在正常组织中，RASSF1A基因呈现广泛表达，但在包括骨肉瘤在内的多种恶性肿瘤中表达均呈现降低或者缺失［22］。高甲科等［23］发现在骨肉瘤组织中RASSF1A蛋白的阳性率(45.70%)显著低于骨软骨瘤组织中RASSF1A 蛋白的阳性率(95.00%)(P ＜0.01)，甚至有个别低分化骨肉瘤组织中的RASSF1A未表达，他们认为这是由启动子区域的 CpG岛甲基化及基因突变、缺失协同作用引起的，且甲基化是该过程中的主导因素。牛军涛等［24］在通过RT-PCR和Western blot方法验证了骨肉瘤中完全或部分甲基化抑制RASSF1A基因表达的前提下，采用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)方法对44例临床明确诊断的骨肉瘤及癌旁骨组织 RASSF1A基因的甲基化状态进行检测和分析，结果表明RASSF1A基因骨肉瘤组织中的甲基化率(61.4%)显著高于其在癌旁正常骨组织中的甲基化率(20.5%)，提示在骨肉瘤组织中具有肿瘤特异性的RASSF1A基因异常甲基化可能在骨肉瘤发生的早期过程中发挥着重要的作用。另有研究显示RASSF1A基因的的异常甲基化与肿瘤的分化程度、恩耐基(Enneking)分期、远处转移情况及患者血清中的碱性磷酸酶)水平密切相关，而与患者的年龄、性别、肿瘤的部位及大小无关［25］。可见检测RASSF1A甲基化水平对于骨肉瘤的早期诊断及预后评价均有一定的参考价值。

3.1.2 p14ARF基因 p14ARF基因是由位于人类第9号染色体短臂(9p21)上的INK4a/ARF基因座编码而成的抑癌基因。作为细胞周期依赖性激酶抑制基因的可变读框基因，p14ARF基因可直接结合癌基因MDM2，阻止MDM2介导的针对p53的泛素化抑制，从而达到稳定p53水平的作用，最终启动细胞凋亡或细胞周期阻滞。p14ARF基因的转录也受其启动子区域甲基化的调节。Oh等［26］采用MSP方法对32例骨肉瘤组织样本p14ARF基因启动子区域甲基化状态进行评估，结果显示47%的样本中存在p14ARF基因启动子区域的高甲基化，且甲基化组患者的生存率(31%)明显低于非甲基化组(79%)，说明p14ARF基因异常甲基化可导致骨肉瘤患者预后不良。但也有学者提出骨肉瘤组织样本p14ARF基因的甲基化率仅为23.5%，且甲基化组的肿瘤转移率明显低于非甲基化组，说明p14ARF基因的异常甲基化与骨肉瘤患者的预后良好呈正相关［27］。可见，该基因甲基化在骨肉瘤中的表达及与预后的关系尚存在争议。

3.1.3 ESR1基因 ESR1基因负责编码雌激素受体蛋白1(estrogen receptor protein 1，ESRP1)，甲基化则是其转录抑制和表达沉默的主要原因。由于雌激素在青春期骨骼生长和成人骨重建中发挥了重要的调节作用，因此许多研究表明ESR1基因不仅通过调控雌激素在骨矿化过程中产生效应，而且该基因纯合性的缺失与严重的骨质疏松和骨转换率增加密切相关［28］。有研究发现虽然骨肉瘤患者组中ESR1基因的异常甲基化率仅为14.7% ，但从5年生存率和生存曲线两方面对比均提示未发生ESR1基因甲基化的患者预后优于甲基化组［27］。

3.1.4 PTEN基因 作为一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN基因的异常甲基化也在骨肉瘤的发生、发展中起重要作用。何博等［29］发现在组织细胞和外周血样中，骨肉瘤患者PTEN基因启动子区域的甲基化率均明显高于正常人;将启动子区域上的CpG岛位点进行区分，得到了异常甲基化易发生(非稳定)的位点，从而为今后骨肉瘤早期诊断乃至靶向治疗提供了理论依据。

3.2 甲基化与骨肉瘤治疗 由于传统的手术治疗创伤性较大，辅助化疗选择性不高、毒副作用大及存在耐药性，导致骨肉瘤的治疗预后较差。以甲基化为基础的探索性治疗为骨肉瘤的治疗提供了新途径，其主要集中在抑癌基因的去甲基化及辅助化疗增敏作用上［30-31］。

由于DNA甲基化主要依赖于DNMT的催化作用，故应用DNMT抑制剂可使高甲基化的抑癌基因重新去甲基化并激活，进而抑制肿瘤［32］。作为DNMT抑制剂的代表性药物5-氮杂-2'脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR)，通过与 DNMT共价结合来抑制其生物活性。梁德勇等［33］在证实骨肉瘤HS888T细胞系中存在抑癌基因APAF-1甲基化的基础上，用5-Aza-CdR处理Hs888T细胞后发现APAF-1的mRNA得以重新表达，且其表达具有对该药物作用时间和浓度的依赖性。有研究在使用5-Aza-CdR处理骨肉瘤MG-63细胞系中高甲基化的RASSF1A基因时也得到了相似的结论，说明5-Aza-CdR无组织或基因特异性，其可激活多种抑癌基因共同抑制骨肉瘤的生长［34］。

目前国内外常规采用甲氨喋呤、多柔比星、顺铂联合异环磷酰胺的方案对骨肉瘤进行化疗，但该方案尚存在化疗耐药的问题。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methytransferase，MGMT)基因具有将结合在鸟嘌呤O6-位点上的甲基基团转移到自身半胱氨酸残基上，从而修复DNA链上鸟嘌呤的功能。在正常细胞中，这种功能会使其自身不可逆的失活［35］。而在肿瘤细胞中，MGMT的过度甲基化导致MGMT的失活和合成间平衡的破坏。一方面，MGMT失去了对DNA的保护，使其易受外界烷化剂的影响进而导致肿瘤的发生;另一方面，MGMT的失活又使形成的肿瘤对烷化剂化疗药物的敏感性明显增强。这种看似矛盾的特性提示MGMT异常甲基化的监测不仅有利于肿瘤的早期诊断，且对于诸如骨肉瘤等早期不宜发现的恶性肿瘤，有助于预测烷化剂化疗的效果。有研究显示MGMT基因甲基化患者对常规化疗药物(含有烷化剂)的反应性明显好于未甲基化者，这也进一步验证了MGMT基因甲基化与化疗疗效的关系［36］。基于此，有人提出通过监测骨肉瘤细胞中MGMT基因及其甲基化水平，指导合理使用烷化剂，进行个体化治疗［37］。也有人提出联合应用MGMT活性抑制剂和化疗药物可显著提高肿瘤对顺铂等烷化剂的敏感性，但由于该种方法亦可能促进体内正常组织细胞的癌变，因而函待进一步的研究［38］。

4 结 语

综上所述，DNA的异常甲基化在骨肉瘤的发生发展及转移中发挥了重要的作用。因此，针对骨肉瘤中癌基因、转移正相关基因及抑癌基因异常甲基化的研究，有望为其治疗提供新的途径。由于骨肉瘤细胞基因甲基化的遗传相对较稳定，提示可寻找骨肉瘤相对特异的异常甲基化谱用于诊治［39］。另外，由于去甲基化和增强甲基化存在作用范围的不确定性和破坏正常DNA结构的矛盾性，这些治疗手段均有促进肿瘤转移和生长的风险［40］。故最佳干预方法应该是针对甲基化基因的靶向治疗，这将是我们今后研究的重点和目标。

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