桃红四物汤对产后血瘀证大鼠Rho／ROCK通路RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白表达的影响

李白坤，朱继民，梁 杰，刘竹青，李珊珊，彭代银

（1.安徽中医药大学药学院 安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽合肥 230031；2.安徽中医药大学中西医结合临床学院，安徽合肥 230038）

桃红四物汤对产后血瘀证大鼠Rho／ROCK通路RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白表达的影响

李白坤1，2，朱继民2，梁 杰1，刘竹青1，李珊珊1，彭代银1

（1.安徽中医药大学药学院 安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽合肥 230031；2.安徽中医药大学中西医结合临床学院，安徽合肥 230038）

目的 探讨桃红四物汤治疗产后血瘀证的作用机制。方法 采用米非司酮（8.3mg／kg）和米索前列醇（0.1mg／kg）灌胃早孕鼠，复制血瘀证产后大鼠模型，将模型复制成功的大鼠随机分为模型组、阳性对照组（法舒地尔，10mg／kg）及桃红四物汤组（9.0g／kg），并设立正常对照组；通过观察大鼠子宫形态及血液流变学指标变化评价桃红四物汤治疗产后血瘀证的疗效，采用免疫印迹法测定ras同源基因A（ras homolog gene，member A，RhoA）、磷酸化RhoA（phospho－RhoA，p－RhoA）蛋白及纤溶酶原激活剂抑制物（plasminogen activator inhibitor－1，PAI－1）的表达水平。结果 桃红四物汤能够明显减轻模型大鼠子宫的炎性反应及红细胞的渗出和聚集，降低全血黏度和血浆黏度（P＜0.05，或P＜0.01），下调p－RhoA及PAI－1蛋白的表达水平（P＜0.01）。结论 桃红四物汤治疗产后血瘀证的机制与下调Rho／ROCK通路相关蛋白的表达水平有关。

桃红四物汤；Rho／ROCK通路；血瘀证

根据中医学“若瘀血不去，则新血不生”（唐容川《血证论·产血》）的病机，临床实践证实只有活血祛瘀才能达到祛瘀生新的目的。桃红四物汤对血瘀证的疗效已为许多研究［1－3］证实，且其对血瘀证的治疗作用可能与溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）含量有关［4］。研究显示，血液中LPA的含量可在一定程度上反映血瘀证的发展与转归，且可通过G12／13蛋白激活ras同源基因（ras homolog gene，Rho）／Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated coiled coil－forming protein kinase，ROCK）通路［5－6］；而Rho／ROCK信号通路能参与调节一些常见心脑血管疾病的病理过程，在参与血栓性疾病中扮演着重要的角色［78］。故推测桃红四物汤的活血祛瘀作用可能与Rho／ROCK通路有关，但目前尚未见到相关研究报道。本研究以产后血瘀证大鼠为研究对象，从分子水平观察桃红四物汤对Rho／ROCK信号通路ras同源基因A（ras homolog gene family，member A，RhoA）、磷酸化RhoA（phospho－RhoA，p－RhoA）蛋白及纤溶酶原激活剂抑制物（plasminogen activator inhibitor－1，PAI－1）表达水平的影响。

1 材料

1.1 动物 健康SD大鼠100只，雌性70只，雄性30只，鼠龄10月龄，体质量（230±20）g，由安徽省实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK（皖）2011－002。

1.2 药物 桃红四物汤（桃仁、当归、白芍各9g，红花、川芎各6g，熟地黄12g）购自安徽省合肥乐家老铺中药饮片有限公司。先将药材用10倍于生药材量的双蒸水浸泡1h，然后再煎煮2次（每次先武火煮沸20min，再文火煎煮40min），最后再浓缩至0.9g／ml。米非司酮片由北京紫竹药业有限公司生产，批号43110811；米索前列醇片由北京紫竹药业有限公司生产，批号43110111。RhoA、p－RhoA及PAI－1抗体购自Bioworld公司。

2 方法

2.1 模型复制与给药 随机留取10只雌性大鼠作为正常对照组，其余大鼠适应性饲养后雌鼠与雄鼠以2∶1合笼，次日晨进行阴道栓和阴道涂片镜检，以发现阴道栓和精子的当天为妊娠第1天。于妊娠第7天分别灌胃米非司酮（8.3mg／kg，上午8点）和米索前列醇（0.1mg／kg，下午6点）复制模型［8］。通过血液流变学相关指标的变化判断产后血瘀模型是否复制成功［9］。选取模型复制成功的大鼠27只，随机分为3组，每组9只。即桃红四物汤组（桃红四物汤9.0g／kg，相当于成人临床用量的10倍），阳性对照组（法舒地尔10mg／kg）和模型组（生理盐水）。自由饮食，采用灌胃方式给药（10ml／kg），每日2次，连续7d。

2.2 观察指标

2.2.1 标本采集：末次给药1h后，将全部大鼠用35g／L水合氯醛（10ml／kg）腹腔注射麻醉，切开腹腔暴露腹主动脉，穿刺腹主动脉取血并抗凝，取适量抗凝血用于血流变学指标检测。迅速取出Y形子宫并剪开，一侧放入10％中性甲醛中固定24h，石蜡包埋后用于形态学观察；另一侧子宫标本用滤纸吸干后，立即置于液氮中速冻，然后转入－80℃冰箱中冻存，用于相关蛋白检测。

2.2.2 指标检测：采用旋转式血液流变仪检测血液黏度指标，包括全血低切变率黏度（5s－1）、全血中切变率黏度（30s－1）、全血高切变率黏度（200s－1）、血浆黏度。将大鼠子宫石蜡包埋标本切片，行苏木精－伊红（haematoxylin－eosin，HE）染色，借助显微镜（日本Nikon 80i）观察子宫病理改变。采用免疫印迹法检测RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白含量。

2.3 统计学方法 采用SPSS 17.0进行统计学分析。呈正态分布的连续型变量采用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述。模型组与对照组均数比较采用两个独立样本t检验，多组（除正常对照外）间各指标均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用SNK检验。

3 结果

3.1 桃红四物汤对大鼠血液流变学指标的影响 模型组大鼠的全血黏度和血浆黏度均较正常对照组显著增加（P＜0.05，或P＜0.01）；而桃红四物汤组大鼠全血低切黏度、高切黏度及血浆黏度较模型组则显著降低（P＜0.05，或P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血液流变学指标比较（±s）

表1 各组大鼠血液流变学指标比较（±s）

注：与正常对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组 别n全血黏度／（mPa·s）5s－1 30s－1 200s－1血浆黏度／（mPa·s）正常对照10 12.53±1.63 6.34±0.54 4.44±0.39 1.55±0.06模 型9 14.64±2.02＊6.93±0.55＊4.92±0.34＊1.90±0.06＊＊桃红四物汤9 12.59±1.14＃6.44±0.59 4.40±0.32＃＃1.57±0.12＃＃

3.2 桃红四物汤对大鼠子宫形态的影响 正常对照组子宫内膜腺体较大，腺腔未见明显扩张，腺细胞内未见胞浆空泡，间质无水肿，血管切面较小，呈较规则圆形，无充血，其管腔内无红细胞聚集。模型组子宫内膜腺体较小，但间质稍显水肿，并见少量红细胞渗出，血管切面较大、扩张、充血，其管腔内可见红细胞聚集。桃红四物汤组子宫内膜腺体较小，其间质无明显水肿，血管切面也较小，呈圆形，其管腔内仅见少量红细胞。见图1。

图2 Western－blotting法检测各组RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白表达水平

注：A.正常对照组；B.模型组；C.桃红四物汤组。图1 各组大鼠子宫的组织形态变化（HE染色，10×10倍）

表2 各组大鼠RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白表达水平比较（±s）

注：与正常对照组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与阳性对照组比较，△P＜0.05。

组 别n RhoA p－RhoA PAI－1正常对照10 0.507±0.119 0.419±0.110 0.363±0.092模 型9 0.512±0.120 1.955±0.420＊＊2.146±0.460＊＊阳性对照9 0.489±0.117 1.564±0.322＃1.365±0.271＃＃桃红四物汤9 0.426±0.108 1.225±0.252＃＃△1.489±0.268＃＃

3.3 各组RhoA、p－RhoA及PAI－1蛋白表达水平比较 模型组大鼠子宫p－RhoA及PAI－1蛋白表达水平较正常对照组显著增加（P＜0.01）。桃红四物汤组与阳性对照组p－RhoA及PAI－1蛋白表达水平较模型组显著降低（P＜0.05，或P＜0.01），药物组p－RhoA蛋白表达水平显著低于阳性对照组（P＜0.05）。各组RhoA蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2和表2。

4 讨论

桃红四物汤为中医临床广泛使用的活血祛瘀代表方剂之一，但其作用机制至今尚未完全阐明。前期研究结果提示，桃红四物汤对血瘀证的治疗作用可能与其降低血液中LPA含量有关，且剂量为9.0 g／kg时其作用更显著［4］，这也是本研究仅设置一个药物剂量的依据。同时有研究提示，LPA能通过G12／13蛋白激活Rho／ROCK信号通路，进而激活该通路下游纤溶系统相关效应蛋白PAI－1而发挥作用［10］。

本研究结果显示：模型组大鼠子宫腺体缩小，间质水肿，红细胞渗出，血管充血，血管腔内出现红细胞聚集等，其全血黏度和血浆黏度均较正常对照组显著增加（P＜0.05），这些提示产后血瘀证大鼠模型复制成功。与模型组比较，桃红四物汤组大鼠子宫炎性反应明显减轻，红细胞渗出及聚集轻微，全血黏度（低切、高切）和血浆黏度显著降低（P＜0.05），这些提示桃红四物汤对产后血瘀证具有较好的治疗作用。免疫印迹法实验结果显示，桃红四物汤能在一定程度上抑制血瘀证大鼠p－RhoA及PAI－1蛋白的表达。结合前期的研究结果［4］，说明桃红四物汤治疗产后血瘀证的机制与其干预LPA－Rho／ROCKPAI－1信号通路有关。本研究结果为进一步揭示桃红四物汤治疗产后血瘀证的科学内涵提供了参考。

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Effect of Taohong Siwu Decoction on Protein Expression of RhoA，p－RhoA，and PAI－1in Rho／ROCK Pathway in Postpartum Rats with Blood Stasis Syndrome

LI Bai－kun1，2，ZHU Ji－min2，LIANG Jie1，LIU Zhu－qing1，LI Shan－shan1，PENG Dai－yin1
（1.School of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine ＆Anhui Province Key Laboratory of R＆D of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230031，China；2.Clinical School of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China）

Objective To investigate the effect of Taohong Siwu Decoction（TSD）on the protein expression of ras homolog gene family，member A（RhoA），phospho－RhoA（p－RhoA），and plasminogen activator inhibitor－1（PAI－1）in the Rho／ROCK pathway in postpartum rats with blood stasis syndrome（BSS）.Methods A postpartum rat model of BSS was induced by intragastric administration of mifepristone（8.3 mg／kg）and misoprostol（0.1mg／kg）in early pregnant rats.The model rats were randomly divided into model group，positive control group，and TSD group，and the positive control group and TSD group received fasudil（10mg／kg）and TSD（9.0g／kg），respectively；normal female rats were selected as normal control group.The efficacy of TSD in the treatment of postpartum BSS was evaluated based on the changes in uterus morphology and hemorheological indices.The protein expression levels of RhoA，p－RhoA，and PAI－1were determined by Western blotting.Results Compared with the model group，the TSD group had significantly reduced inflammatory response of the uterus and exudation and aggregation of erythrocytes，significantly decreased blood viscosity and plasma viscosity（P＜0.05or P＜0.01），and significantly down－regulated protein expression of p－RhoA and PAI－1（P＜0.01）.Conclusion TSD is effective in the treatment of postpartum BSS，which is related to the down－regulation of p－RhoA and PAI－1in the Rho／ROCK pathway.

Taohong Siwu Decoction；Rho／ROCK pathway；blood stasis syndrome

R285.5

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.01.022

2013－10－15）

国家自然科学基金项目（81073091）；安徽中医学院自然科学研究基金项目（2011zr006B）

李白坤（1979－），女，硕士，讲师

彭代银，pengdy＠ahtcm.edu.cn