新藤黄酸通过内质网应激诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的研究

戴婷婷，程 卉，苏婧婧，李庆林

（省部共建新安医学教育部重点实验室 安徽中医药大学科研实验中心，安徽合肥 230038）

新藤黄酸通过内质网应激诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的研究

戴婷婷，程 卉，苏婧婧，李庆林

（省部共建新安医学教育部重点实验室 安徽中医药大学科研实验中心，安徽合肥 230038）

目的 研究新藤黄酸（gambogenic acid，GNA）诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的机制。方法 采用不同浓度的GNA作用细胞24h，对照组是相同浓度GNA加内质网应激抑制剂4－苯基丁酸（4－phenylbutyric acid，4－PBA）共同作用HCT116细胞24h。采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）染色测定两组细胞增殖抑制率的差异，采用吖啶橙（acridine orange，AO）和溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色观察细胞的形态学变化，采用膜联蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ，AV）－异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）／碘化丙碇（propidium iodide，PI）双重染色检测细胞凋亡率。结果 内质网应激抑制剂4－PBA可以缓解GNA对HCT116细胞增殖的抑制作用；AO／EB染色后荧光显微镜观察发现GNA作用的细胞具有凋亡特征；流式细胞仪检测显示4－PBA可降低HCT116细胞的凋亡率。结论 GNA能抑制人结肠癌细胞HCT116增殖，诱导细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的作用可能与内质网应激途径有关。

新藤黄酸；人结肠癌细胞HCT116；细胞凋亡；内质网应激

藤黄作为我国一种传统的中药，具有良好的药用价值。藤黄味酸涩、有毒，具有攻毒蚀疮、破血散结等功效，主治痈疽、肿毒、顽癣、恶疮、跌打损伤，创伤出血及烫伤等［1－2］。1984年，吕归宝［3］从中药藤黄中提取得到新藤黄酸（gambogenic acid，GNA）。经过研究表明，GNA较藤黄酸具有抗癌谱广、抗癌作用强和毒性低等特点。细胞凋亡是细胞产生的一种程序性死亡过程，是细胞受损后积极主动发生的一种应对机体损伤的生理过程。细胞内经典的凋亡途径主要有死亡受体活化和线粒体途径，内质网应激介导的凋亡途径是近年来发现的新的凋亡途径。周兰贞等［4］已经验证GNA可以通过影响HCT116细胞周期相关蛋白，使细胞阻滞在G0／G1期，进而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。本实验在此基础上进一步研究GNA是否通过影响内质网应激途径发挥诱导HCT116细胞凋亡的作用，采用内质网应激抑制剂4－苯基丁酸（4－phenyl butyric acid，4－PBA）阻断人结肠癌细胞HCT116的应激反应，以探究内质网应激在GNA诱导HCT116细胞凋亡中的作用。

1 材料

1.1 细胞 人结肠癌HCT116细胞株：购自中国科学院昆明细胞库。

1.2 主要药物及试剂 GNA（亮黄色干燥粉末，纯度99.0％，批号2012120101）：由安徽中医药大学药物化学教研室提供；RPMI－1640培养基干粉：Gibco公司，批号08612；胎牛血清：杭州四季青生物工程公司，批号110117；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）：Amresco公司，批号0793；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：Amresco公司，批号201110108662；膜联蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ，AV）－异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）／碘化丙碇（propidium iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒：南京凯基生物公司；4－PBA：Sigma公司，批号STBD2912V；胰蛋白酶：Sigma公司，批号0458；吖啶橙（acridine orange，AO）和溴化乙锭（ethidium bromide，EB）：Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器 Olympus CKX41倒置显微镜和Olympus BX51荧光显微镜：日本Olympus公司；96孔、6孔平底培养板：美国Corning costar公司；SpectraMax M2e酶标仪：美国Molecular Devices公司；MCO－175CO2培养箱：日本三洋公司；JW2502电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；LD4－8型低速离心机：北京医用离心机厂；FACS Calibur流式细胞仪：美国Becton Dickinson公司。

2 方法

2.1 细胞培养 人结肠癌细胞株HCT116用含10％胎牛血清、100U／ml青霉素和100U／ml链霉素的RPMI－1640培养基培养于培养瓶中，于5％ CO2、37℃、相对饱和湿度的培养箱中培养。2～3d消化传代1次。取对数生长期的细胞用于实验。

2.2 MTT法检测细胞增殖抑制作用 将对数生长的HCT116细胞消化后用RPMI－1640培养基调整为6×104／ml的浓度，再接种于96孔板中，每孔100μl，每组设3个复孔，培养过夜后待细胞贴壁再加入终浓度为2.5、5.0、7.5μmol／L的GNA培养液100μl，GNA与4－PBA联用组加入2.5、5.0、7.5 μmol／L的GNA和5mmol／L 4－PBA培养液100 μl，空白对照组加入100μl完全培养基。37℃、5％ CO2、相对饱和湿度的培养箱中继续培养24h，每孔加入5.0g／L的MTT溶液20μl，继续培养4h后，吸去上清液后每孔加入150μl DMSO，震荡15min后用自动酶标仪检测570nm波长处的光密度（optical density，OD）值，计算细胞活力。细胞活力＝

2.3 AO／EB染色检测HCT116细胞的凋亡 取对数生长期的HCT116细胞接种于6孔板中，培养过夜后加入不同浓度GNA继续培养24h。弃去原培养液，再加入新培养基，每孔加入100μg／ml AO染液和100μg／ml EB染液，避光孵育15min，弃原培养基，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗3遍后于荧光显微镜下检测。

2.4 流式细胞仪AV－FITC／PI双染法检测HCT116细胞凋亡率 取对数生长期的HCT116细胞接种于6孔板中，培养过夜后加入不同浓度GNA继续培养24h后，弃培养基，用冷PBS洗细胞2次，弃去PBS，再用不含有乙二胺四乙酸二钠的胰酶消化，终止消化，再用PBS洗涤细胞2次，2 000 r／min离心5min，收集1×105细胞。加入400μl的AV－FITC混匀后，4℃条件下作用15min，再加入10μl PI，混匀，避光孵育5min。于1h内采用流式细胞仪检测HCT116细胞凋亡率。

2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0进行统计学分析。连续型变量采用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述。两组间均数比较采用Dunnett's T3法（方差不齐）或LSD法（方差齐），以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 MTT法检测GNA和4－PBA对人结肠癌细胞HCT116活力的影响 2.5、5.0、7.5μmol／L的GNA作用HCT116细胞24h后，细胞活力随GNA浓度的增加而明显降低。4－PBA与各浓度GNA作用HCT116细胞24h与单独给予GNA组比较，细胞存活力均显著增高（或P＜0.01）。见图1。

图1 GNA和4－PBA对人结肠癌HCT116细胞活力的影响（n＝3）

3.2 荧光显微镜观察HCT116细胞凋亡 5.0 μmol／L GNA作用HCT116细胞24h后，倒置荧光显微镜下可见HCT116细胞表现明显的凋亡现象，而5.0μmol／L GNA与4－PBA联用可明显改善细胞的凋亡现象。见图2。

注：A.空白对照组；B.5.0μmol／L GNA＋4－PBA组；C.5.0μmol／L GNA组。图2 倒置荧光显微镜下各组HCT116细胞凋亡情况（AO／EB双重染色，0×20倍）

3.3 AⅤ－FITC／PI染色流式细胞仪检测HCT116细胞凋亡率 2.5、5.0μmol／L的GNA作用HCT116细胞24h后，细胞凋亡率随浓度增加而增加，而与4－PBA联用后，细胞的凋亡率明显下降。见图3。

图3 不同浓度GNA和4－PBA联合作用24h后HCT116细胞凋亡率比较

4 讨论

结肠癌是发生在胃肠道系统中严重威胁人类身体健康的恶性肿瘤。在经济发达的欧美国家，结肠癌致死率在所有癌症致死率中排名第二，而在中国，结肠癌发病率也呈逐年上升的趋势。结肠癌早期治疗与其他常见癌症一样，主要通过手术切除的方式，但术后容易出现转移和复发，此时一些化疗药物就对后期治疗起到重要作用，但目前针对肿瘤治疗的药物存在不良反应较多以及毒性较大的问题。近年来，中药在肿瘤治疗中显现出不良反应少、可持续应用的优势。藤黄就是研究较广的一种抗肿瘤药物。GNA是从中药藤黄中提取的新的抗肿瘤化合物。曲宝玺等［5］通过研究发现GNA可以显著抑制小鼠白血病L1210细胞的增殖生长。近年来，本实验室通过体内、体外实验证明GNA对人结肠癌细胞HT－29、人白血病细胞K562、人肝癌细胞BEL－7402、人非小细胞肺癌细胞A549和人鼻咽癌细胞CNE－1都具有生长抑制作用［6－8］。

细胞凋亡是细胞产生的一种程序性死亡过程，是细胞受损后积极主动发生的一种应对机体损伤的生理过程。细胞内经典的凋亡途径主要有死亡受体活化和线粒体途径，内质网应激介导的凋亡途径是近年来发现的新的凋亡途径。

内质网是细胞内由精细的膜系统组成的细胞器，是细胞内一些大分子物质如蛋白质和脂质合成的场所，可以调节胞内蛋白质的折叠和转运，同时也是细胞内钙离子水平调节的重要场所。当外界的一些刺激扰乱内质网中平衡因子时就会中断蛋白质合成信号，造成内质网内未折叠蛋白或错误折叠蛋白的聚集，扰乱内质网稳态，最终导致内质网应激［910］。此时，细胞就会启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）以应对内质网应激对细胞造成的损害。UPR的启动有利于暂缓内质网内未折叠蛋白反应以及清除错误折叠蛋白反应。内质网应激时，UPR通过PKR样内质网激酶至真核起始因子2α（PKR－like endoplasmic reticulum kinase－eukaryotic initiation factor 2α，PERK－eIF2A）、肌醇需要酶1至X抗原结合蛋白1（inositol－requiring enzyme 1－X－box binding protein－1，IRE1－XBP1）和激活转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）三条信号通路减少内质网内未折叠蛋白或错误折叠蛋白的聚集，减轻累积的蛋白质对细胞造成的损害，恢复内质网的稳态，使应激细胞得以存活。但持续剧烈的内质网应激发生时就会使UPR的促生存模式转向促凋亡模式［11－13］。

本实验通过GNA与内质网应激抑制剂4－PBA联用研究内质网应激在GNA对人结肠癌细胞HCT116生长的作用。首先采用MTT法研究GNA与4－PBA联用对细胞的增殖抑制作用，实验表明：GNA可浓度依赖性地抑制HCT116细胞的生长增殖，而与5.0mmol／L的4－PBA联用可缓解GNA对细胞的增殖抑制作用。为近一步研究GNA是否诱导细胞凋亡，笔者采用AO／EB荧光染色观察细胞形态学变化。正常细胞的细胞膜完整，AO染成均匀一致的绿色，而EB可以把受损的细胞染成橘红色。实验结果表明：4－PBA可显著降低GNA诱导HCT116细胞的凋亡现象。为验证GNA是通过内质网应激诱导细胞凋亡的，笔者以GNA与4－PBA联用，AⅤ－FITC／PI双重染色法用流式细胞仪检测4－PBA对GNA诱导细胞凋亡的影响。结果显示：4－PBA与GNA联用可以显著降低GNA诱导HCT116细胞的凋亡率，说明GNA可通过内质网应激诱导人结肠癌细胞HCT116凋亡。

［1］明·李时珍.本草纲目：第2册［M］.北京：人民卫生出版社，1977：1344.

［2］南京医学院.药材学［M］.北京：人民卫生出版社，1960：1161.

［3］吕归宝.藤黄中新藤黄的分离及其结构［J］.药学学报，1984，19（8）：636－639.

［4］周兰贞，晏烽根，李庆林.新藤黄酸诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的作用机制研究［J］.肿瘤，2011，31（7）：580－584.

［5］曲宝玺，郝晓阁，李德华.藤黄Ⅱ号抗肿瘤作用的实验研究［J］.中国肿瘤临床，1991，18（1）：50－52.

［6］Li QL，Cheng H，Zhu GQ，et al.Gambogenic acid inhibits proliferation of A549cells through apoptosis－inducing and cell cycle arresting［J］.Biol Pharm Bull，2010，33（3）：415－420.

［7］晏烽根，李庆林.新藤黄酸诱导人鼻咽癌细胞CNE－1凋亡以及对p－p38和p－ERK1／2蛋白的影响［J］.中国药理学通报，2011，27（3）：355－359.

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［12］Tabas I，Ron D.Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress［J］.Nat Cell Biol，2011，13（3）：184－190.

［13］Timmins JM，Ozcan L，Seimon TA，et al.Calcium／calmodulin－dependent protein kinaseⅡlinks endoplasmic reticulum stress with Fas and mitochondrial apoptosis pathways［J］.J Clin Invest.2009，119（10）：2925－2941.

Gambogenic Acid Induces Apoptosis of Human Colon Cancer HCT116 Cells through Endoplasmic Reticulum Stress

DAI Ting－ting，CHENG Hui，SU Jing－jing，LI Qing－lin
（Key Laboratory of Xin'an Medicine Jointly Supported by Ministry of Education and Anhui Province＆Experimental Research Center，Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China）

Objective To investigate the mechanism by which gambogenic acid（GNA）induces the apoptosis of human colon cancer HCT116cells.Methods Experimental HCT116cells were treated with 2.5，5.0，and 7.5μmol／L GNA for 24h，while control HCT116cells were treated with 2.5，5.0，and 7.5 μmol／L GNA plus 5μmol／L endoplasmic reticulum stress（ERS）inhibitor 4－phenylbutyric acid（4－PBA）for 24h.The cellular proliferation inhibition rate was measured by methyl thiazolyl tetrazolium assay；the morphological changes of HCT116cells were observed by acridine orange（AO）／ethidium bromide（EB）staining under a fluorescence microscope；the cell apoptosis rate was determined by flow cytometry with annexin V－fluorescein isothiocyanate（FITC）／propidium iodide（PI）double staining.Results The ERS inhibitor 4－PBA reduced the inhibitory effect of GNA on the proliferation of HCT116cells.The AO／EB staining indicated the characteristics of apoptosis in GNA－treated HCT116cells under the fluorescence microscope.The flow cytometry with annexinⅤ－FITC／PI double staining showed that 4－PBA reduced the apoptosis rate of GNA－treated HCT116cells.Conclusion GNA can inhibit proliferation and induce apoptosis in HCT116cells，and it might induce cell apoptosis through ERS.

gambogenic acid；human colon cancer HCT116cell；cell apoptosis；endoplasmic reticulum stress

R285.5

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.01.023

2013－10－29）

安徽省自然科学基金项目（11040606M190）；国家自然基金项目（81173600）

戴婷婷（1987－），女，硕士研究生

李庆林，qinglin＿lee＠hotmail.com