高效液相色谱－蒸发光散射法检测芪白平肺胶囊中3种人参皂苷含量

王 斌，孟 楣，刘先华，周 安，王传博，童佳兵，李泽庚

（1.安徽中医药大学科研实验中心，安徽合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥 230031；3.安徽医科大学第二附属医院，安徽合肥 230601；4.国家中医药管理局慢性阻塞性肺疾病肺气虚证重点研究室，安徽合肥 230038）

高效液相色谱－蒸发光散射法检测芪白平肺胶囊中3种人参皂苷含量

王 斌1，孟 楣2，刘先华1，周 安1，王传博3，童佳兵2，李泽庚4

（1.安徽中医药大学科研实验中心，安徽合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥 230031；3.安徽医科大学第二附属医院，安徽合肥 230601；4.国家中医药管理局慢性阻塞性肺疾病肺气虚证重点研究室，安徽合肥 230038）

目的 采用高效液相色谱仪－蒸发光散射检测器（high performance liquid chromatography－evaporative light scattering detector，HPLC－ELSD）建立芪白平肺胶囊中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量测定方法。方法 采用色谱柱为Hypersil ODS XB－C8柱（4.6mm×250mm，5μm）和Hypersil ODS XB－C18柱（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈为流动相A、以水为流动相B进行梯度洗脱；洗脱程序（0～40min，A 19％；40～55min，A 19％～40％），流速为1.2ml／min，柱温为30℃。ELSD参数优化：漂移管温度分别设为50、70、90、110℃，载气流量分别为1.0、1.2、1.4、1.6L／min。结果 通过对比研究，最终采用Hypersil ODS XB－C8柱作为分析柱，漂移管温度为90℃，载气流量为1.2L／min时，3种人参皂苷的含量检测结果最佳。人参皂苷Rg1、Re和Rb1的加样回收率分别为98.3％、99.1％、101.8％，RSD分别为0.67％、1.03％、1.22％。结论 所选择的色谱柱和优化的ELSD参数可准确测定芪白平肺胶囊中3种人参皂苷的含量，且重现性好。

芪白平肺胶囊；高效液相色谱－蒸发光散射检测法；人参皂苷；含量测定

芪白平肺胶囊是安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，含有黄芪、人参、川芎、地龙、五味子、葶苈子、薤白7味中药［1］，其中黄芪和人参为君药。临床和药效学实验［2－5］表明，芪白平肺胶囊可用于治疗慢性阻塞性肺疾病。本研究采用高效液相色谱仪－蒸发光散射检测器（high performance liquid chromatography－evaporative light scattering detector，HPLC－ELSD）对芪白平肺胶囊中3种人参皂苷的含量进行测定，以探讨该制剂的质量控制方法。

1 仪器与试药

Agilent 1260型HPLC（包括二元泵、恒温自动进样器、柱温箱、380－LC型ELSD检测器）：美国安捷伦公司；BP211D型十万分之一电子天平：德国赛多利斯公司；HS10260D型超声清洗器：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；人参皂苷Re（批号110754－201123）、人参皂苷Rg1（批号110703－201128）和人参皂苷Rb1（批号110754－201122）对照品：由中国食品药品检定研究院提供。芪白平肺胶囊（批号20120104、20120813、20130320）：由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供；黄芪、人参、川芎、地龙、五味子、葶苈子、薤白：购于安徽省合肥乐家老铺中药饮片有限公司，由安徽中医药大学第一附属医院李立华主任药师鉴定；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备：精密称定人参皂苷Rg1对照品1.8mg；人参皂苷Re对照品1.0mg；人参皂苷Rb1对照品2.5mg；加甲醇溶解，配置成混合对照品贮备液（人参皂苷Rg1、Re和Rb1对照品质量浓度分别为72、40、100mg／L）。

2.1.2 供试品溶液的制备：取胶囊内容物2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇80ml超声处理30min，滤过，蒸干，水转移残渣至分液漏斗中，乙醚脱脂后，用水饱和的正丁醇萃取4次（依次为40、30、30、20ml），合并正丁醇液，20ml氨试液洗涤2次，正丁醇液蒸干，甲醇溶解并转移至10ml容量瓶中，定容，冷藏备用。

2.1.3 阴性样品溶液的制备：按组方取10粒量的缺人参药材，依照处方制备工艺制得缺人参胶囊内容物4.0g，取2.0g按“2.1.2项”下的供试品溶液制备方法，得阴性样品溶液10ml。

2.2 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱为Hypersil ODS XB－C8（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈为流动相A、以水为流动相B进行梯度洗脱（0～40 min，A 19％；40～55min，A 19％～40％），流速为1.2 ml／min，柱温为30℃。ELSD参数：漂移管温度为90℃，载气流量为1.2L／min，进样量为20μl。在选定条件下，人参皂苷Rg1、Re和Rb1与样品中其他组分色谱峰可基线分离，且阴性样品在人参皂苷Rg1、Re和Rb1出峰处无干扰，理论塔板数以人参皂苷Rg1、Re和Rb1计均大于10 000。见图1。

图1 样品、混合对照和阴性样品的高效液相色谱图

2.3 线性关系考察 分别吸取混合对照品溶液5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0μl注入液相色谱仪，分别以3个对照品的6个进样量的常用对数（lgx）为横坐标，以峰面积的常用对数（lgy）为纵坐标，进行线性回归，人参皂苷Rg1、Re和Rb1的线性回归方程分别为：lgy1＝1.657 6lgx1＋1.402 3， r1＝0.999 1；lgy2＝1.372 8lgx2＋1.518 7，r2＝0.999 3；lgy3＝1.936 9lgx3＋1.251 3，r3＝0.999 2。结果表明，人参皂苷Rg1、Re和Rb1进样量分别在0.36～7.20μg、0.20～4.00μg和0.50～10.00μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验 分别吸取混合对照品溶液20μl，参照“2.2”项下的色谱条件，重复进样6次，测定峰面积。结果表明，人参皂苷Rg1、Re和Rb1峰面积的RSD（n＝6）分别为0.86％、0.78％和0.42％，表明精密度良好。

2.5 稳定性试验 取供试品溶液（批号20120104）在0、2、4、8、12、24h分别进样20μl，记录峰面积。结果表明，人参皂苷Rg1、Re和Rb1峰面积的RSD分别为0.98％、1.03％、1.65％。表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.6 重复性试验 取同一批号的样品（批号20120104），按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，测得峰面积并计算含量。结果表明，人参皂苷Rg1、Re和Rb1含量的RSD分别为1.31％、1.45％和1.13％。提示该方法重复性较好。

2.7 回收率试验 精密称取已知含量的样品（批号20120104）2.0g，共6份，按“2.1.2”项下方法处理，加入等质量浓度的人参皂苷Rg1、Re和Rb1对照品，测定，计算回收率。见表1。

表1 加样回收率实验结果

2.8 样品含量测定 取3批胶囊内容物（批号分别为20120104、20120813、20130320），每批3份，按“2.1.2”项下方法制备3批供试品溶液，共9份。参照“2.2”项下的色谱条件各进样20μl，记录峰面积，代入标准曲线，按照标准曲线法计算样品中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量。测得人参皂苷Rg1、Re、Rb1的平均含量分别为0.332 5、0.376 5、1.162 5 mg／g。

3 讨论

3.1 检测器的选择 原来参照文献［6］用高效液相色谱－紫外检测法测定人参皂苷Rg1、Re和Rb1含量，但受噪音和梯度洗脱的影响，造成基线漂移。并且芪白平肺胶囊为复方，所含成分较多，若使用较低的紫外检测波长（203nm）检测，则导致紫外末端吸收，杂质对色谱峰的干扰也较大。而ELSD作为一种通用质量型检测器，其响应不依赖样品的光学性质，只要样品的挥发性低于流动相即可被检测，不存在紫外末端吸收的问题，且对流动相的变化不敏感，即使在梯度洗脱时基线也很平稳［7］。通过调节ELSD的漂移管温度与载气流速，可以使基线噪音最小，响应值相对最高，从而获得很好的色谱图。所以本实验最终采用HPLC－ELSD法测定人参中皂苷类成分。

3.2 色谱条件的优化

3.2.1 色谱柱的优化：在色谱柱的选择上，本研究对比了Hypersil ODS XB－C8柱（4.6mm×250 mm，5μm）和Hypersil ODS C18柱（4.6mm×250 mm，5μm）在同等条件下对样品中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的分离效果，结果显示前者可实现3种皂苷的有效分离，效果更佳，故最终选择C8柱对样品进行检测。

3.2.2 流动性比例的选择：由于样品色谱图中峰较多，且实现人参皂苷Rg1、Re的有效分离要求较高，故对流动相配比进行了考察。经多次摸索发现，流动相在40min前采用等度洗脱（0～40min，乙腈19％）可得到人参皂苷Rg1、Re的单峰，并实现了二者的分离。40min后采用梯度洗脱（40～55min，乙腈19～40％）可获得理想分离度的人参皂苷Rb1的单峰。所以最终采用此洗脱方法。

3.3 ELSD条件的优化 选用ELSD检测器时，蒸发温度和载气流速对测定结果影响很大。蒸发温度低时，溶剂挥发不完全；温度高时，由于分析样品部分挥发，导致颗粒量下降而使检测器响应下降［8］。本实验将漂移管温度分别设定为50、70、90、110℃，结果显示漂移管温度为90℃时检测器响应最好，故最终选择90℃作为蒸发温度。载气流速是另一个影响测定结果的重要参数，当载气的流速太低时，会形成大量的微粒从而导致尖峰信号或噪声信号；当载气流速太高时，微粒量会下降，从而导致信号响应降低［8］。本实验将载气流速分别设定为1.0、1.20、1.40、1.60L／min，结果显示载气流速为1.20L／min时检测器响应最好，故最终选择1.20L／min的载气流速。

［1］葛平，陈娟，李泽庚，等.芪白平肺胶囊定性定量方法研究［J］.安徽医药，2012，16（10）：1415－1418.

［2］李泽庚，王传博，彭波，等.芪白平肺胶囊对慢性阻塞性肺疾病患者BODE指数的影响［J］.中医杂志，2010，51（11）：987－989.

［3］王传博，李泽庚，彭波，等.芪白平肺胶囊对慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺证模型大鼠NO、ET－1及FIB的影响［J］.中华中医药杂志，2012，27（1）：91－93.

［4］李泽庚，王传博，彭波，等.芪白平肺胶囊对慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺证模型大鼠血气分析的影响［J］.时珍国医国药，2010，21（3）：569－570.

［5］李泽庚，王传博，彭波，等.芪白平肺胶囊对慢阻肺痰瘀阻肺证模型大鼠肺功能的影响［J］.上海中医药大学学报，2009，23（6）：51－53.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：8.

［7］赵宇新，李曼玲.蒸发光散射检测器在中药成分分析中的应用［J］.中国中药杂志，2003，28（10）：913－917.

［8］石威，王玉堂，权新军，等.高效液相色谱－蒸发光散射检测法测定人参根中人参皂苷的含量［J］.分析化学，2006，34（2）：243－246.

Determination of Three Ginsenosides in Qibai Pingfei Capsules by High－Performance Liquid Chromatography－Evaporative Light－Scattering Detector

WANG Bin1，MENG Mei2，LIU Xian－hua1，ZHOU An1，WANG Chuan－bo3，TONG Jiabing2，LI Ze－geng4
（1.Experimental Research Center，Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China；2.The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230031，China；3.The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Anhui Hefei 230601，China；4.Key Laboratory of Chronic Obstructive Pulmonary Disease with Lung－Qi Deficiency Syndrome，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038，China）

Objective To establish a method for determining the content of ginsenosides Rg1，Re，and Rb1in Qibai Pingfei Capsules by high－performance liquid chromatography－evaporative light－scattering detector（HPLC－ELSD）.Methods HPLC was performed on a Hypersil ODS XB－C8column（4.6mm×250mm，5μm）or Hypersil ODS XB－C18column（4.6mm×250mm，5μm）with acetonitrile and water as mobile phases A and B for gradient elution（0－40min，A 19％；40－55min，A 19％－40％）at a flow rate of 1.2ml／min and a column temperature of 30℃.For ELSD parameters，the drift tube temperature was set at 50℃，70℃，90℃，or 110℃，and the carrier gas flow rate was set at 1.0L／min，1.2L／min，1.4L／min，or 1.6L／min.Results By contrast，the determination of three ginsenosides in Qibai Pingfei Capsules had the optimal results when Hypersil ODS XB－C8column was used as the analysis column，the drift tube temperature was set at 90℃，and the carrier gas flow rate was set at 1.2L／min.The average recoveries of ginsenosides Rg1，Re，and Rb1were 98.3％（RSD＝0.67％），99.1％（RSD＝1.03％），and 101.8％（RSD＝1.22％），respectively.Conclusion The HPLC－ELSD method using selected chromatographic column and optimized ELSD parameters has high accuracy and good repeatability in determining the content of ginsenosides Rg1，Re，and Rb1in Qibai Pingfei Capsules.

Qibai Pingfei Capsule；high－performance liquid chromatography－evaporative light－scattering detector；Ginsenoside；content determination

R284.1

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.01.027

2013－07－15）

安徽高校省级自然科学研究项目（KJ2011Z218）；安徽省中医发展专项（皖中医药﹝2012﹞10号）；安徽中医学院青年科学研究基金项目（2012qn020）

王斌（1983－），男，硕士

李泽庚，li6609＠126.com