二甲双胍通过抑制MAPK信号通路增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性*

谢娅张颖史明星

二甲双胍通过抑制MAPK信号通路增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性*

谢娅①张颖①史明星①

目的：探讨二甲双胍是否可以提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性及相关的作用机制。方法：BRDU ELISA方法检测顺铂联合或者不联合二甲双胍对SKOV3细胞增殖的影响；二甲双胍联合或者不联合MAPK信号通路阻断剂后BRDU ELISA方法检测细胞增殖的变化。Western blotting检测二甲双胍作用下卵巢癌细胞系SKOV3的磷酸化AMPK/总AMPK水平和磷酸化p38 MAPK/总MAPK水平的变化。结果：（1）二甲双胍不仅能抑制卵巢癌细胞系SKOV3细胞的增殖，而且能提高对顺铂的敏感性，并且这种作用是依赖于AMPK激活的；（2）p38 MAPK阻断剂SB203580能够抑制SKOV3的增殖，二甲双胍能够增强这种抑制作用。结论：二甲双胍可增强顺铂对卵巢癌细胞的抑制作用，并且二甲双胍可能通过激活AMPK信号通路进而抑制MAPK信号通路增加顺铂对卵巢癌细胞的抑制增殖作用。

二甲双胍； 卵巢癌； AMPK； MAPK； 顺铂； 细胞增殖

卵巢癌是死亡率最高的一种妇科恶性肿瘤，大约70%的患者就诊时已经是晚期（FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期）。卵巢癌的标准治疗是首次肿瘤细胞减灭术，接着每3周1次的铂类和紫杉醇联合化疗。虽然卵巢癌手术和化疗技术已经得到很大发展，但由于对化疗不敏感和化疗耐药的发生，目前晚期卵巢癌5年生存率不到30%[1-3]。因此，急需找寻一种新的提高化疗效果的治疗方法以改善卵巢癌患者的预后。

MAPK信号通路在多种恶性肿瘤（包括卵巢癌）细胞的增殖、凋亡和化疗药物作用及化疗药物耐受发生中起重要作用[4-6]。MAPK家族包括p38 MAPK、细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）等多个亚家族。这些亚族组成多条信号通路，其中最主要的有P38途径、ERK1/2途径和JNK途径。MAPK家族成员被磷酸化激活后，将细胞外的各种刺激信号传递到细胞内，引起细胞内级联反应，调节细胞的增殖、凋亡及对药物的敏感性[7]。有研究发现激活的AKT和MAPK，依次磷酸化BAD和BCL-2，进而削弱铂类和紫杉烷的促进细胞凋亡作用[8]。笔者前期研究发现MAPK信号通路在晚期上皮性卵巢癌组织中异常激活，并发现磷酸化p38 MAPK在耐药卵巢癌组织中表达较非耐药卵巢癌组织中升高。

二甲双胍是一种用于治疗2型糖尿病的双胍类降糖药，最近两项大型流行病学调查研究表明：长期服用二甲双胍能够降低卵巢癌的发病率，而且二甲双胍能够显著延长卵巢癌合并糖尿病患者的无进展生存期[9]。二甲双胍通过STK11（也称LKB1）激活AMPK，激活过程涉及多个参与细胞增殖调节的信号通路，其中包括MAPK信号通路[10]。但二甲双胍是否能够增加化疗药物对卵巢癌细胞的敏感性及相关的作用机制研究尚属空白。

本研究首先观察二甲双胍对卵巢癌细胞增殖的影响，以及二甲双胍是否可增强顺铂的化疗敏感性，并通过检测二甲双胍对化疗药物相关的重要信号通路MAPK信号通路的调节作用来探讨相关的作用机制。以期寻找能提高卵巢癌化疗敏感性的新的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 细胞系和试剂 人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3，中、高分化，贴壁生长，购于中国医学科学院细胞库，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞系常规3～5 d传代。兔抗人p38 MAPK多克隆抗体、兔抗人P-p38 MAPK单克隆抗体；兔抗人AMPK多克隆抗体、兔抗人P-AMPK单克隆抗体，兔抗人GAPDH单克隆抗体购自Cell signaling公司；二甲双胍、顺铂购自美国Sigma公司，胎牛血清购自杭州四季青公司；Western blotting检测试剂盒购自武汉博士德公司；Trizol 试剂购自美国Invitrogen公司；BrdU标记及检测试剂盒购自德国Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 Brdu检测细胞增殖 用BrdU-ELISA试剂盒（Roche）检测细胞增殖的变化。不同浓度二甲双胍对SKOV3细胞增殖的影响：取对数生长期的SKOV3细胞，消化后调整细胞浓度为1.0×105/mL，加入96孔板中，每孔200 μL。（1）二甲双胍组：加入不同浓度二甲双胍（0.01 mM、0.1 mM、1 mM）；（2）对照组：加入等量的PBS为对照组。加入等量含2%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO2、相对湿度90%的培养箱中培养48 h后，BRDU法检测不同浓度二甲双胍对SKOV3细胞增殖的影响。

取对数生长期的SKOV3细胞，消化后调整细胞浓度为1.0×105/mL，加入96孔板中，每孔200 μL。实验分组：（1）顺铂组：将顺铂加到细胞悬液中，终浓度分别为1、2、4、6 ng/mL；（2）二甲双胍+顺铂组：将顺铂加到细胞悬液中，终浓度分别为1、2、4、6 ng/mL，并均加入二甲双胍至终浓度为0.1 mM，每一浓度设3个平行孔，共两组；将细胞置于37 ℃、5% CO2、相对湿度90%的培养箱中培养48 h后，BrdU-ELISA试剂盒检测细胞增殖的变化。实验过程：细胞用10 μL/well BrdU labeling solution 37 ℃孵育2 h，倒掉labeling solution，加入200 μL/well Fix Denat 20 ℃孵育30 min，倒掉Fix Denat液，加入100 μL/well anti-BrdU-POD工作液20 ℃孵育90 min，然后去除工作液，用洗液洗3次。最后，去除洗液，加入100 μL/well底物液20 ℃孵育20 min，然后加入25 μL的1 M H2SO4，1 min后用450 nm波长检测吸光值（参考波长：690 nm），每次3个复孔，重复3次实验。同时用MTT方法验证BrdU技术的有效性（数据中没有显示）。方法同上，实验重复3次。

1.2.2 Western blotting 取对数生长期的SKOV3细胞，消化后调整细胞浓度为5.0×105/mL，加入6孔板中，每孔2 mL，孵育24 h后加药。实验分组：二甲双胍组：将二甲双胍（10、20 mM）加入细胞悬液，每一浓度设3个平行孔；对照组：加入与二甲双胍等量的PBS。加入等量含2%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO2、相对湿度90%的培养箱中培养。孵育12 h后，提取两组细胞总蛋白，Western blot法检测AMPK、photo-AMPK/Total-AMPK、Photo-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白的表达情况。具体步骤如下： 用 RIPA（1% NP40，0.5 sodium deoxycholate and 0.1% SDS）提取细胞蛋白，加样于10% SDS-PAGE中，然后转到硝酸纤维素膜上。用5%的脱脂牛奶和0.1% Tween室温孵育1 h，然后用一抗（Cyclin D1，photo-AMPK，total-AMPK，GAPDH）4 ℃孵育（1：1000，CST）过夜。用PBST洗膜5 min，3次后，HRP连接的二抗（1：2000，CST）孵育2 h。最后再用PBST洗膜5 min，3次。用ECL试剂盒检测硝酸纤维素膜上的条带。用GAPDH（1：1000，CST）来校正上样量。蛋白条带包括GAPDH，均用Quantity One（Bio-Rad，Hercules，CA）成像程序检测光密度值。实验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，组间差异采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二甲双胍抑制卵巢癌细胞增殖的情况 二甲双胍能够抑制卵巢癌细胞增殖，并且这种抑制作用能够被Compound C所削弱。随着二甲双胍浓度（1×10-3mol/L，1×10-4mol/L，1×10-5mol/L）的增加，其对卵巢癌细胞SKOV3增殖的抑制作用逐渐增强（*P＜0.05，**P＜0.01）。其中1×10-4mol/L 和1×10-5mol/L的二甲双胍能够显著抑制子宫内膜癌细胞的生长。而AMPK阻断剂Compound C（5×10-7mol/L，1×10-6mol/L）均可削弱二甲双胍的这种抑制卵巢癌细胞增殖的作用。1×10-6mol/L Compound C与二甲双胍联合应用，其对卵巢癌细胞增殖的抑制作用与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 二甲双胍抑制卵巢癌细胞增殖情况

2.2 二甲双胍能够增强卵巢癌对顺铂的敏感性 将不同浓度的顺铂（1、2、4、6 ng/L）加入卵巢癌细胞SKOV3中，加入或者不加入0.1 mM二甲双胍孵育细胞48 h后，结果表明：0.1 mM的二甲双胍联合顺铂（1、2、4、6 ng/mL）作用于卵巢癌细胞时，顺铂抑制卵巢癌细胞生长的作用显著增强（P＜0.05）。其中6 ng/mL顺铂联合0.1 mM的二甲双胍对卵巢癌细胞的抑制作用最显著（P＜0.05），见图2。

2.3 二甲双胍联合p38 MAPK阻断剂SB203580能够增强二甲双胍的抗卵巢癌细胞增殖的作用 单独应用SB203580（5、10 μM）能抑制卵巢癌SKOV3的增殖，差异有统计学意义（P＜0.05）。二甲双胍（0.1 mM）和SB203580（5、10 μM）联合应用对卵巢癌细胞SKOV3增殖的抑制作用显著增强（*P＜0.05，**P＜0.01）。其中0.1 mM二甲双胍与10 μM p38 MAPK阻断剂SB203580联合应用对卵巢癌细胞SKOV3增殖的抑制作用最显著（**P＜0.01），见图3。

图2 两组对顺铂敏感性的比较

图3 二甲双胍联合p38 MAPK阻断剂SB203580增强二甲双胍的抗卵巢癌细胞增殖情况

2.4 二甲双胍激活AMPK信号通路，并抑制MAPK信号通路 二甲双胍（10、20 mM）作用卵巢癌细胞SKOV3 6 h后，磷酸化AMPK水平显著增高，且升高的磷酸化AMPK水平能够被AMPK阻断剂Compound C所削弱。经二甲双胍（1、10 mM）处理后，卵巢癌细胞SKOV3中磷酸化p38 MAPK蛋白水平显著降低，见图4。

图4 卵巢癌细胞SKOV3中磷酸化p38MAPK蛋白水平（经二甲双胍处理后）

3 讨论

最近两项大型流行病学资料显示：（1）长期服用二甲双胍可降低卵巢癌的发病风险；（2）在合并糖尿病的卵巢癌患者中，服用二甲双胍的患者较未服用患者的无病进展存活率显著增加[10-11]。笔者研究结果发现，二甲双胍能够抑制卵巢癌细胞增殖，这种作用是通过激活AMPK信号通路实现的。AMP激活蛋白激酶（AMPK）是主要的细胞能量调节器，是代谢和肿瘤互相作用的主要调节子[11]。二甲双胍以一种非胰岛素介导的方式直接调节细胞增殖和凋亡，二甲双胍通过激活AMPK，激活的AMPK调节多个信号通路，其中包括mTOR和MAPK信号通路，最终调节细胞增殖和凋亡。

化疗药物引起的细胞损伤主要是通过、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路实现的，并且化疗药物耐受的形成也与MAPK信号通路激活密切相关[6]。MAPK家族包括P38MAPK、细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）等多个亚家族。这些亚族组成多条信号通路，其中最主要的有P38途径、ERK1/2途径。MAPK信号通路在多种恶性肿瘤（包括卵巢癌）细胞的增殖、凋亡和化疗耐药产生过程中发挥重要作用[6]。MAPK家族成员被磷酸化激活后，将细胞外的各种刺激信号传递到细胞内，引起细胞内级联反应。有研究发现激活的MAPK，依次磷酸化BAD和BCL-2，进而削弱铂类和紫杉烷的促进细胞凋亡作用，使肿瘤细胞对化疗药物产生抵抗[12]。笔者的研究结果表明：二甲双胍可能通过激活AMPK信号通路，进而抑制MAPK信号通路来抑制卵巢癌细胞增殖的。这与以上研究结果相一致。

笔者的研究结果还发现：二甲双胍（0.1 mM）能够增强顺铂抑制卵巢癌细胞增殖作用。与最近的几项研究结果一致：二甲双胍能改善乳腺癌化疗耐药，并且发现二甲双胍的这种对化疗耐药的调节作用是通过激活AMPK实现的[13]。Tseng 等[16]在非小细胞肺癌细胞中发现二甲双胍不仅能够降低紫杉醇诱导p38 MAPK介导的切除修补基因（ERCC1）的表达，还能够增加紫杉醇诱导的细胞毒效应。另外在肺癌、乳腺癌和前列腺癌裸鼠体内模型中，二甲双胍能够显著增强顺铂、紫杉醇和多柔比星对肿瘤细胞生长的抑制作用，并且二甲双胍能够减少多柔比星的用量，延长疾病缓解期[14-15]。但这些结果说明二甲双胍可能通过激活AMPK调节肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

笔者同时发现，二甲双胍联合MAPK信号通路抑制剂能够增强二甲双胍的抗肿瘤作用。p38 MAPK、p42 MAPK信号通路抑制剂可增加二甲双胍和紫杉醇的抗肿瘤作用[16]。Liu 等[17]在乳腺癌中发现二甲双胍和mTOR抑制剂（RAD001）联合可增强化疗药物的细胞毒作用，联合应用二甲双胍、化疗药物和mTOR阻断剂能够协同抑制乳腺癌细胞增殖。Monteagudo等[18]在前列腺癌细胞中，p42 MAPK siRNA能够显著增强二甲双胍的抗肿瘤作用。因此，铂、紫杉醇化疗的基础上联合二甲双胍和信号通路阻断剂可能会增强卵巢癌化疗的疗效，这些研究结果都与笔者的研究结果一致。

总之，二甲双胍能够提高卵巢癌细胞系SKOV3细胞对顺铂的敏感性，并且这种作用是依赖于AMPK激活的；p38 MAPK阻断剂SB203580也能够抑制SKOV3的增殖，二甲双胍能够增强这种抑制作用。二甲双胍的这种增强卵巢癌细胞对顺铂敏感性的作用可能是通过激活AMPK，从而抑制MAPK信号通路实现的。笔者的研究结果为临床应用二甲双胍及MAPK信号通道阻断剂来提高卵巢癌化疗药物的敏感性提供理论支持，为卵巢癌的临床联合用药提供新思路。

[1] Roshan A，Stan B.Ovarian cancer： stategies for overcoming resistance to chemotherapy[J].Nature Reviews Cancer Volume，2003，3（1），502-516.

[2]周凤珍，周霞平.卡铂联合多西他赛及吉西他滨治疗复发性卵巢癌的临床分析[J].中国医学创新，2011，8（36）：26-28.

[3]刘晓文，胡明英.AKT基因被RNA干扰抑制后对卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响[J].中国医学创新，2011，8（36）：1-2.

[4]范炳娟，张颖.对卵巢癌腹腔镜术后转移扩散的研究[J].中国医学创新，2013，10（12）：150-152.

[5]刘莹，张颖.卵巢癌临床治疗回顾及展望[J].中国医学创新，2013，10（12）：153-154.

[6] Rajesh K，Lawrence D M.Multidrug resistance （MDR） in cancer：Mechanisms， reversal using modulators of MDR and the role of MDR modulators in influencing the pharmacokinetics of anticancer drugs[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences，2000，11（4）：265-283.

[7] Fecher L A，Amaravadi R K，Flaherty.The MAPK pathway in melanoma[J].Curr Opin Oncol，2008，20（2），183-189.

[8] Ohta T，Ohmichi M，Hayasaka T，et al.Inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase increases efficacy of cisplatin in vivo ovarian cancer models[J].Endocrinology，2006，147（14）：1761-1769.

[9] Rattan R，Gin S，Hartmann L C，et al.Metformin attenuates ovarian cancer cell growth in an AMP-kinase dispensable manner[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine，2011，15（1）：166-178.

[10] Iris L，Romero A，Cormick M，et al.Relationship of type Ⅱdiabetes and metformin use to ovarian cancer progression， survival，and chemosensitivity[J].Obstet Gynecol，2012，119（1）：61–67.

[11] Michael B，Claudia B，Christian M，et al.Use of metformin and the risk of ovarian cancer： a case-control analysis[J].Gynecologic Oncology，2011，123（12）：200-204.

[12] Deyin X，Sandra O.Modeling resistance to pathway-targeted therapy in ovarian cancer[J].Cell Cycle，2005，4（8）：1004-1006.

[13] Hyung G K，Tran T H， Eun H H，et al.Metformin inhibits P-glycoprotein expression via the NF-κB pathway and CRE ranscriptional activitu through AMPK activation[J].British Journal of Pharmacology，2011，162（15）：1096-1108.

[14] Iliopoulos D，Hirsch H A，Struhl K.Metformin decreases the dose of chemotherapy for prolonging tumor remission in mouse xenografts involving multiple cancer cell types[J].Cancer Res，2010，7（2）：3196-3201.

[15] Rocha G Z，Dias M M，Ropell E R，et al.Metformin amplifies chemotherapy-induced AMPK activation and antitumoral growth[J]. Clin Canc Res，2011，17（4）：3993-4005.

[16] Tseng S C，Huang Y C，Chen H J，et al.Metformin-mediated downregulation of p38mitogen-activated protein kinase-dependent excision repair cross-complementing 1 decreases DNa repair capacity and sensitizes human lung cancer cells to paclitaxel[J].Biochem Pharmacol，2013，85（4）：583-594.

[17] Liu H，Scholz C，Zang C，et al.Metformin and the mTOR inhibitor everolimus （RAD001） sensitize breast cancer cells to the cytotoxic effect of chemotherapeutic drugs in vitro[J].Anticancer Res，2012，32（5）：1627-1637.

[18] Monteagudo S，Pérez-Martínez F C，Pérez-Carrión M D，et al.Inhibition of p42 MAPK using a nonviral vector-delivered siRNA potentiates the anti-tumor effect of metformin in prostate cancer cells[J].Nanomedicine（Lond），2012，7（4）：493-506.

Metformin Enhances Cisplatin Sensitivity through Activating MAPK Signaling Pathway in Ovarian Cancer/

XIE Ya，ZHANG Ying，SHI Ming-xing.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：007-010

Objective：To investigate metformin whether improve the sensitivity of cisplatin in ovarian cancer and explore the underlying mechanisms.Method：Ovarian cancer cell line SKOV3 was used. The expression of phosphorylatedp38MAPK and AMPK were confirmed in ovarian cancer cells by Western blotting. BRDU ELISA KIT was used to analyze the effects of metformin ， SB203580 （p38MAPK inhibitor） and cisplatin alone or together in ovarian cancer cells.Result：（1）Metformin could not only inhibit the proliferation of ovarian cancer cell line SKOV3 cells， but also improve the sensitivity to cisplatin， which is dependent on the activation of AMPK. （2） SB203580， the p38 MAPK inhibitor， could also inhibit the proliferation of SKOV3， which could be enhanced by metformin.Conclusion：Metformin may enhance cisplatin sensitivity through activating MAPK signaling pathway in ovarian cancer cells.

Metformin； Ovarian cancer； AMPK； MAPK； Cisplatin； Cell proliferation

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.003

2014-02-05） （本文编辑：蔡元元）

国家自然科学基金（81202070）

①郑州大学第一附属医院 河南 郑州 450052

谢娅

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China