不同浓度苦参碱、大蒜素对人胃癌细胞株MKN-45杀伤作用的实验研究

佘玉清 陈昱倩 颜延凤 鞠娟 李芳 韩康生

（南京市中西医结合医院，江苏南京 210014）

不同浓度苦参碱、大蒜素对人胃癌细胞株MKN-45杀伤作用的实验研究

佘玉清 陈昱倩 颜延凤 鞠娟 李芳 韩康生

（南京市中西医结合医院，江苏南京 210014）

目的：观察不同浓度苦参碱、大蒜素对人胃癌细胞株MKN-45体外生长的影响。方法：体外培养人胃癌细胞株MKN-45，分别用不同浓度的苦参碱、大蒜素处理，采用CCK-8法检测MKN-45细胞的生长情况。结果：不同浓度的苦参碱及大蒜素作用于MKN-45细胞后，对其增殖均表现出了明显的抑制作用，并表现出浓度与作用时长的依赖性，最高抑制值分别达到了96.82%和93.44%。结论：苦参碱及大蒜素可以抑制胃癌MKN-45细胞的增殖，且与作用时间、剂量呈正相关。

苦参碱 大蒜素 胃癌MKN-45细胞 实验研究

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率较高，为胃癌治疗寻找高效低毒的植物提取药，已成为目前的研究热点[1]。苦参碱是中药材苦参、山豆根的主要活性成分，具有抗炎、抗纤维化、抗病毒等生物学活性。近年来，国内外医学研究发现苦参碱在抗癌方面具有明显功效[2]。大蒜素具有抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等功能，对乳腺癌、皮肤癌、结肠癌等均有抑制作用。流行病学研究表明，长期大量食用大蒜素者胃癌的发病率、死亡率均明显下降，大蒜的年摄入量与胃癌发病率成负相关[3]。此次我们通过体外实验研究不同浓度的大蒜素与苦参碱对人胃癌细胞株MKN-45的增殖是否具有明显的抑制作用，现将结果报道如下。

1 实验材料

1.1 细胞与试剂人胃癌MKN-45细胞为本实验室保存，购自上海生命科学院细胞所。DMEM细胞培养基购自Inventrogen公司，胎牛血清购自杭州四季青试剂公司，CCK-8购自Sigma公司。大蒜素注射液购自山东鲁抗辰欣药业有限公司，苦参碱注射液购自广州明兴制药厂。

1.2 细胞培养人胃癌MKN-45细胞在37℃、5%CO2条件下，用含10%胎牛血清（加青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL）的DMEM培养液常规培养。

2 实验方法

2.1 分组实验分为苦参碱组、大蒜素组及阴性对照组。苦参碱终浓度分别为0.05、0.10、0.25、0.50、1.0mg/mL，大蒜素终浓度分别为5、15、25、30、40μg/mL。另设不加药的阴性对照组，仅加入等体积的DMEM细胞培养液。

2.2 CCK-8法检测两种药物对MKN-45胃癌细胞的增殖抑制作用取对数生长期MKN-45细胞，0.25%胰酶消化制成细胞悬液，细胞浓度1×105/mL接种于96孔板中，每孔90μL，空白孔加入90μL DMEM，37℃、5%CO2培养箱培养24h。后按一定质量浓度梯度分别加入苦参碱、大蒜素，每孔100μL，阴性对照组加入等体积DMEM液，每个浓度3个复孔。继续培养6、24、48、72h后，每孔加入CCK-8 10μL继续培养4h，酶标仪450nm波长下测定各孔吸光度A值，按下列公式计算抑制率：细胞增殖抑制率=[1－（A给药组－A空白孔）／（A阴性对照组－A空白孔）]×100%。以上实验重复3次。

2.3 统计学方法采用SPSS16.0软件统计数据，变量均采用（x±s）表示，两样本均数间的比较用t检验，多样本均数间比较用单因素方差分析，统计学差异的标准为P＜0.05。

3 实验结果

3.1 苦参碱注射液对人胃癌MKN-45细胞增殖抑制率的影响见表1。当苦参碱浓度为0.05mg/mL时，48h抑制率为5.73%，72h抑制率为6.43%。但当浓度增加到1.0mg/mL时，48h抑制率为90.81%，72h抑制率更是达到了96.82%。这说明苦参碱注射液在浓度为0.05～1.0mg/mL范围内，随着药物浓度的增加和处理时间的延长，对MKN-45细胞的增殖抑制率逐渐增加，存在时间和剂量依赖性（P＜0.01），各个浓度的生长抑制率之间存在显著性相关（ANOVA，P=0.000）。

表1 不同浓度苦参碱不同作用时间对胃癌细胞株MKN-45的增殖抑制率（x±s，n=9）%

3.2 大蒜素对MKN-45细胞增殖抑制率的影响见表2。随着大蒜素浓度的增加和作用时间的延长，对MKN-45细胞的增殖抑制率逐渐增加，且各个浓度的生长抑制率之间存在显著性相关（ANOVA，P=0.000）。在大蒜素浓度为5μg/mL时就出现了对人胃癌MKN-45细胞株的增殖抑制作用，48h与72h增殖抑制率分别为4.88%与5.91%；当大蒜素浓度增加到40μg/mL时，48h与72h增殖抑制作用最强，分别为92.57%与93.44%。

4 讨论

恶性肿瘤是中国人的第二大死因，而在我国因胃癌引发的死亡居恶性肿瘤死亡首位[4]。目前经典的化疗药物因毒副作用较大和化疗耐药限制了其在临床的应用，传统中药逐渐成了目前较热门的抗肿瘤研究方向。

近年来，体外实验研究中发现苦参碱可明显地诱导骨肉瘤、人乳腺癌及肝癌细胞等的凋亡[5-7]。本研究结果显示，不同浓度的苦参碱均可以明显抑制人胃癌MKN-45细胞的增殖，在一定的浓度范围内（0.05～1.0mg/mL），其对人胃癌MKN-45细胞的增殖抑制与时间和浓度呈正相关。其抗肿瘤的作用机制主要包括诱导肿瘤细胞凋亡、分化、自噬以及细胞毒等多种作用[8-9]。林氏等[10]研究表明，苦参碱可明显抑制黏附因子CD44、CD49的表达，抑制肿瘤细胞与内皮细胞的黏附，减轻内皮细胞的通透性，从而减少肿瘤的转移。Dai等[11]发现苦参碱可抑制胃癌细胞系SGC-7901的增殖，并可使细胞的形态学发生变化，还可导致细胞的caspase-3含量明显升高，从而促进细胞凋亡。

大蒜素的抗癌作用在对照人群研究和临床研究中已经被证实，其作用机制主要有抑制致癌物的激活、抑制肿瘤细胞的转移和侵袭、诱导细胞凋亡、影响细胞周期、对细胞骨架的破坏作用、抑制血管生成等[12]。大蒜素的主要成分为二烯丙基三硫，占40%以上。二烯丙基三硫对胃液中分离出的硝酸盐还原菌的生长及其产生亚硝酸盐的能力均有明显的抑制作用。已有大量动物实验证实，大蒜素具有预防胃癌发生的作用。本研究结果进一步显示了大蒜素在体外对人胃癌MKN-45细胞的增殖具有抑制作用，并且随着大蒜素药物的浓度和用药时间的增加，其增殖抑制作用就更为明显。研究表明，大蒜素可通过第二信号系统cAMP、PKC途径，增强细胞凋亡始动基因fas及凋亡促进基因box表达，抑制凋亡抑制基因bcl-2的表达，从而提高细胞凋亡率，诱导胃癌细胞凋亡，并抑制其增殖活性，揭示了大蒜素诱导胃癌细胞凋亡的机制[3]。

综上所述，苦参碱和大蒜素注射液在体外可直接抑制或杀伤人胃癌MKN-45细胞，具有较强的增殖抑制及杀伤能力，并且呈现与时间和浓度的正相关性。因此，这两种药物都是具有广泛应用前景的抗肿瘤药物。

表2 不同浓度大蒜素不同作用时间对胃癌细胞株MKN-45的增殖抑制率（±s，n=9）%

表2 不同浓度大蒜素不同作用时间对胃癌细胞株MKN-45的增殖抑制率（±s，n=9）%

注：同一时间不同浓度与阴性对照组比较均P＜0.01；同一浓度不同时间比较均P=0.000。

0（阴性对照组）6h 5μg/mL2.83±1.734.71±0.894.88±0.685.91±1.33 15μg/mL6.92±2.978.91±1.8214.82±3.5717.93±5.37浓度24h48h 0 72h 0 0 0 25μg/mL11.83±2.8620.56±2.1125.28±4.4432.78±6.91 30μg/mL26.91±5.5739.91±5.1968.45±8.2461.95±4.90 40μg/mL39.96±4.8868.44±11.7492.57±9.9293.44±6.99

[1]朱艳琴，鲁光华，徐玉芳.MTT法检测体外培养人胃癌细胞株MGC-803对苦参素注射液的药物敏感性.中国药理学通报，2006，22（10）：1278

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[12]蒋淑婉，李云，陈鹤.大蒜素的抗肿瘤作用及其机制研究进展.医学综述，2013，19（8）：1420

编辑：吴宁

R735.2

A

1672-397X（2014）11-0082-02

佘玉清（1971-），女，医学硕士，副主任中医师，研究方向：中西医结合治疗内分泌系统疾病。Susan710316@163. com

2014-06-18