卡托普利对心梗后心衰大鼠尿液代谢组学的影响1）

李琪琳，褚瑜光，胡元会，刘瑞华，王映红，苗朝霞

代谢组学是研究生物体受病理生理刺激或基因改变而引起的体内代谢物动态变化的一门科学，其研究的技术和方法日趋成熟，在病变标志物的发现、疾病的诊断和治疗、药物药效及毒理安全性评价等方面得到了广泛的应用［1－3］。ACEI类药物被公认为治疗心力衰竭的重要药物，卡托普利作为ACEI的代表，已被证实其可以有效抑制RAAS，限制心室重构，降低心衰患者的发病率和死亡率［4］。本研究采用1H－NMR 技术研究卡托普利对心梗后心衰大鼠尿液代谢组学的影响，进一步探讨卡托普利治疗心衰的机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 正常雄性SD 大鼠20只（体重200g～250g），购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK（京）2012－0001），分笼饲养于中国中医科学院广安门医院SPF 级动物房。

1.2 实验药物 卡托普利（批号：20100329）。

1.3 实验仪器 Bruker AVANCE Ⅲ－600 MHz超导傅立叶变化核磁共振波谱仪（Bruker Corporation，Switzerland），主要配置：场强为11.75T（500MHz）的超导磁体，1H／13C／31P／19F四核探头、梯度反相探头（109Ag－31P）、固体高分辨魔角旋转探头（15N－31P）；HX－200 动 物 呼 吸 机（成 都 泰 盟 科 技 有 限 公 司）；Value plus 系 列 超 低 温 冰 箱（Thermo Revco，USA）；Cenirifuge5415D 台式低温1－15pk超速离心机（Eppendorf－MiniSpin／plus，German）。

1.4 动物模型复制 参照Pfeffer［5］报道的方法复制心衰动物模型。

1.5 实验分组 动物购回后喂养标准合成饲料，适应性喂养3 d，禁食12h后造模。术后24h对模型大鼠行超声心动图检测，以射血分数（EF）减损＞15%为入选标准。将入选模型大鼠随机分为模型组、卡托普利组，每组大鼠不少于6只。

1.6 实验给药 模型组生理盐水4.0ml／kg灌胃，每天一次；卡托普利组100mg／kg溶于生理盐水中灌胃。各组连续给药8周。

1.7 尿液采集及处理 各组大鼠灌胃8周后，以代谢笼收集大鼠24h尿液，经4℃，12 000r／min离心15min，取上层尿液，于－80℃冰箱中保存。室温解冻后取20μL上清，添加D2O：H2O 为1∶9和0.05%TSP的混合液40μL，最后将制备好的尿液样品加入1.7 mm 核磁样品管中，使用Bruker AVANCE Ⅲ－600 MHz超导傅立叶变化核磁共振波谱仪进行测量。

1.8 数据采集和处理 分别采用弛豫时间编辑（Carr－Purcell－Meiboom－Gill，CPMG）和 扩 散 编 辑（longitudinal eddy－delay，LED）脉冲序列检测尿液中小分子及大分子代谢物。在超导傅立叶变换NMR 仪上调用NOE 相关2D－NMR 谱（nuclear overhauser effect spectroscopy，NOESY）脉冲序列，设置参数。实验参数：谱宽8 000Hz，预饱和时间为2s，采样点数32k，累加次数128次，预饱和频率和中心频率都在水峰位置。自由感应衰减（free induction decay，FID）信号经过填零为32k点后，再加上0.5Hz的线增宽因子，经傅立叶变换转为1H－NMR 图谱。以TSP的化学位移参考峰的位置，设为0。调用AMIX（Analysis of MIXtures software v.3.0，Bruker Biospin）软件中的程序将0.5～6ppm 范围内的图谱按照每段0.04ppm 进行分段积分。将积分按每张谱的总积分强度归一化。然后以Excel文件贮存，用于模式识别分析。

1.9 统计学处理 数据输入到SIMCA－P12.0软件中进行主成分分析（PCA），为了鉴别区分各组间对代谢轮廓贡献较大的代谢物，将数据进行正交信号校正处理，然后进行偏最小二乘法－判别分析，即O－PLS－DA。结果以得分图和载荷图体现。

2 结 果

2.1 卡托普利组与模型组代谢图谱分析 由PCA 得分图看出，两组小分子（图1）及大分子（图2）代谢图谱均能明显区分，小分子图谱解释度R2Y＝0.926，大分子图谱解释度R2Y＝0.891，说明PCA 模型对样本解释度较高。采用OPLS－DA 对两组间差异代谢物进行分析得出，与模型组相比，卡托普利组谷氨酰胺、肌肝、牛磺酸、柠檬酸、苹果酸、苯基丙氨酸含量升高；3－羟基丁酸、乙酸、丙酮、磷脂酰胆碱、三甲胺、马尿酸含量下降。结果提示卡托普利能有效调节心衰大鼠尿液代谢紊乱，并促使代谢表型向正常范围回归。

图1 卡托普利组与模型组大鼠尿液低场区代谢物变化模式识别得分图及载荷图

图2 卡托普利组与模型组大鼠尿液高场区代谢物变化模式识别得分图及载荷图

2.2 卡托普利组与模型组差异代谢物变化 采用OPLS－DA对组间差异代谢物进行分析，结合主成分载荷图，确定以下物质（见表1）对分类贡献较大。

表1 差异代谢物变化表

3 讨 论

作为各种心脏病的终末段，心力衰竭的高患病率、高死亡率俨然已使其成为人类共同面对的一个公共健康问题。心力衰竭的一个基本病理机制为心室重塑，因此，对于心力衰竭进行有效治疗，关键在于对神经内分泌系统的过渡激活状况予以阻断，避免出现心室重塑。ACEI是目前公认治疗心衰的基石之一，作为一个比较常用的ACEI制剂，卡托普利不但可以抑制血管紧张素转换酶，使AngⅡ生成减少，扩张外周血管，减轻心脏前后负荷，还可以抑制缓激肽的降解，激活磷脂酶A，增加前列腺素水平，抑制RAAS，使β受体密度上调，防治左室重构；同时，还能抑制交感神经活性，纠正心衰患者的电解质紊乱，使血钾、血钠、血镁维持正常，从而降低心律失常及猝死的发生率［6］。但是，卡托普利治疗心衰是否存在其他作用机制，代谢组学技术的发展，为从代谢的角度揭示心衰病理生理学过程的动态变化以及它们所包含的生物学意义提供了新的工具和方法，也为探索ACEI制剂治疗心衰的作用机制提供了新的靶点和思路。

本实验利用1H－NMR代谢组学技术，通过对心衰大鼠代谢物图谱进行多元统计分析和模式识别处理，观察了卡托普利对心衰大鼠尿液代谢的影响。从实验结果看，根据PCA 得分图，模型组与卡托普利组两组小分子及大分子代谢图谱能明显区分，提示卡托普利能调节心衰大鼠代谢紊乱，并促使代谢表型向正常范围回归。

卡托普利组与模型组对比：与能量代谢相关的柠檬酸、苹果酸含量升高；与糖、脂代谢有关的化合物有3－羟基丁酸、丙酮、乙酸、磷脂酰胆碱等浓度降低，与氨基酸代谢有关的化合物有谷氨酰胺、苯基丙氨酸、牛磺酸浓度升高。可见，心梗后心衰大鼠尿液代谢组学出现比较明显的糖、脂、氨基酸、能量代谢紊乱，卡托普利可以有效调节心衰大鼠尿液代谢紊乱，这可能是其治疗心衰的作用机制之一，但其具体的作用途径有待进一步研究。

［1］ Oresic M，Viadal PA，Hanninen V.Metabolomic approaches to phenotype characterization and applications to complex diseases［J］.Expert Rev Mol Diagn，2006，6（4）：575－585.

［2］ Mally A，Ambers A，Hard GC，et al.Are 4－hydroxy－2（E）－nonenal derived mercapturic acids and H－1 NMR metabonomics potential biomarkers of chemically induced oxidative stress in the kidney［J］.Toxicology，2007，230（23）：244－255.

［3］ Bowser R，Cudkowicz M，Kaddurah DR.Biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis［J］.Expert Rev Mol Diagn，2006，6（3）：387－398.

［4］ 黄峻.心力衰竭治疗的基石：血管紧张素转换酶抑制剂［J］.中华心血管病杂志，2002，30（4）：255－257.

［5］ Pfeffer MA，Braunwald E.Ventricular remodelling after myocardial infarction：Experimental observations and clinical implications［J］.Circulation，1990，81：1161－1172.

［6］ 伍尚强.卡托普利对心力衰竭患者的临床疗效观察［J］.中国医疗前沿，2009，4（24）：12－13.