缺氧、氧化应激对视网膜色素上皮细胞增殖及葡萄糖调节蛋白78表达的影响

李漫丽 戚卉 吴雅臻

葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated protein，GRP)78属于热休克蛋白(heat shock protein，HSP)70家族，是内质网上最多的分子伴侣蛋白，被认为是细胞应激反应的标志性分子，并具有保护细胞、抵抗细胞凋亡的作用。GRP78涉及到多种细胞的增殖、存活、转移等演化过程，目前被广泛研究[1]。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞能够分泌一系列细胞因子，调节局部免疫反应，对维持稳定的视网膜免疫环境起重要作用，RPE的异常病理变化在多种视网膜疾病的发生发展过程中起重要作用。本研究通过体外培养人RPE细胞，以氯化钴(cobalt chloride，CoCl2)诱发缺氧模型[2]、过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)诱发氧化应激模型[3-4]，分别观察缺氧、氧化应激对RPE细胞增殖活力的影响及GRP78表达的变化，为研究RPE细胞对不同应激的反应机制提供依据，也为GRP78的功能研究打下基础。

1 材料与方法

1.1主要材料人RPE细胞株(D407)购自中山眼科中心，GRP78多克隆抗体购自Invotrigen公司，免疫组织化学试剂Biotin SP-HRP Kit、DMEM培养基、小牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司，MTT、二甲基亚砜购自美国Sigma公司，细胞培养板购自美国Costar公司。

1.2细胞培养人RPE细胞株(D407)在含体积分数5% CO2的37 ℃培养箱中，用含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基进行贴壁培养，用2.5 g·L-1胰蛋白酶进行消化传代。取对数生长期细胞进行胰蛋白酶消化，用含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基将细胞制成100×103mL-1的细胞悬液，分别接种于96孔、6孔培养板内。96孔培养板以每孔20×103个细胞接种，用于四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞存活率；6孔培养板中预先放入高压灭菌过的玻璃盖玻片，接种细胞密度为2.5×106个·mL-1，每孔2.5 mL细胞悬液，用于细胞爬片行免疫细胞化学染色实验。……