结直肠癌患者血清miR-92a水平测定的临床意义

仇俊兰 奉林

结直肠癌患者血清miR-92a水平测定的临床意义

仇俊兰 奉林

目的探讨血清miR-92a在结直肠癌(CRC)诊断和预后判断中的价值。方法78例结直肠癌患者, 分别为无转移组40例和肝转移组38例, 同时募集40例健康志愿者为健康对照组。应用实时荧光定量PCR法检测miR-92a水平。结果结直肠癌患者血清miR-92a水平显著高于健康对照组(P＜0.01), 用于结直肠癌诊断时的灵敏度为75.3%, 特异度为88.3%；结直肠癌肝转移组血清miR-92a水平显著高于无转移组 (P＜0.05), 鉴别转移性与无转移性CRC患者的敏感性为78.6%, 特异性为86.6%。结论血清miR-92a可能是一种新的生物学标记物用于结直肠癌患者的早期诊断, 其水平上调与结直肠癌患者预后有关。

结直肠癌；血清；微小RNA；生物学标记

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是较常见的胃肠道恶性肿瘤, 在世界范围内经济发达国家的发病率较高, 我国结直肠癌的发病率近年逐年上升, 且有年轻化的趋势。早期结直肠癌多无症状, 大多数患者确诊时已属晚期。影响CRC预后的最主要因素是病期的早晚［1］, 结直肠癌的早期诊断和治疗能够明显延长患者的生存期和生存质量, 明显减少社会医疗成本, 提高肿瘤早期诊断率显得尤为重要。

微小RNA(microRNA, miRNA)由长约21～25核苷酸的双链RNA分子构成, 是非编码小RNA大家族中的成员, 与肿瘤的转移、凋亡有关［2］。与蛋白质标志物相比, miRNA更早出现异常表达, 且检测准确率高, 更利于早期诊断［3］。本文应用实时荧光定量PCR技术测定结直肠癌患者及对照组血清微小RNA(miR-92a)的水平, 为miR-92a用于结直肠癌的早期诊断和预后判断提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院2010年1月～2013年5月诊治的结直肠癌患者78例, 男41例, 女37例, 年龄35～72岁,平均年龄54.01岁。其中无转移组40例, 肝转移组38例,所有患者均经手术及术后病理确诊, 无其他肿瘤病史, 近3个月未接受抗肿瘤治疗。健康对照组为本院体检中心提供的年龄、性别均匹配的40例健康志愿者, 男20例, 女20例,年龄34～68岁, 平均年龄52.96岁。样本采集前均获得知情同意。

1.2检测方法 采集肘静脉血2 ml, 室温放置半小时, 吸取血清, 应用mirVanaTM PARISTM 试剂盒抽提总RNA, NanoDrop ND-1000 spectrophotometer仪测定RNA浓度, miScript Reverse Transcription反转录试剂盒进行血清总RNA 反转录, miScript SYBR Green PCR试剂盒进行PCR反应。血清miR-92a扩增引物为：5’-TATTGCACTTGTCCCGGCCTGT 3’, 内参照［4］采用U6snRNA, 引物为 5'-TTCGTGAAGCGTTCCATATTTT 3'。所有引物由上海欧易生物医学科技有限公司合成。PCR反应条件为：预变性95℃15 min, (94℃15 s, 55℃30 s, 70℃34 s), 40个循环。每个miRNA的相对表达量用2-△△Ct表示, 其中△Ct=CtmiRNA-CtU6。以上实验重复3次。

1.3统计学方法 血清miR-92a测定结果通过Medcalc软件进行Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验；应用受试者工作特征曲线(ROC)分析其用于结直肠癌诊断时的灵敏度和特异度, P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

结直肠癌患者的血清miR-92a水平显著高于健康对照者(P＜0.01), 结直肠癌肝转移组血清miR-92a水平显著高于无转移患者(P＜0.05), 见表1。ROC曲线分析显示, 血清miR-92a相对定量值(临界值为0.105)用于结直肠癌诊断时的灵敏度为75.3%, 特异度为88.3%, 曲线下面积(AUC)为0.863, 差异有统计学意义(P＜0.01)。在临界值为0.173时, 区分转移性与无转移性患者的敏感性为78.6%, 特异性为86.6%, AUC为0.896, 差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1血清miR-92a的相对定量值

3 讨论

目前发现, 在肿瘤中miRNA与肿瘤代谢相关因子如细胞凋亡因子、生长因子、生长因子受体等靶基因结合而参与肿瘤的发生发展过程, 各种不同的肿瘤组织、正常组织, 甚至分化水平相同的不同肿瘤细胞均具有各自特异的miRNA表达谱［5］, 因而可根据不同肿瘤特征性的miRNA对其作出准确诊断。研究表明, 血清中miRNA可作为肿瘤细胞存在的直接证据, 能有效区分肿瘤患者和健康人群［6］, 与组织中miRNA相比较, 血清检测的优势在于无创便捷和水平稳定,且血清或血浆中的miRNA于常温孵育24 h或以上、反复冻融样本多次或强酸强碱、甚至煮沸均不影响稳定性［7］, 相反,外源性miRNA在加入血浆后则很快被降解, 因此, 血液是理想的miRNA的检测样本。

肿瘤的早期诊断, 除了正确选择生物学标记物和合适的检测样本外, 理想的检测方法也是提高肿瘤检测特异性的重要方面。血清miRNA的检测方法, 目前主要有荧光定量聚合酶链反应 (RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)等。本研究应用实时荧光定量PCR法测定血清miR-92a水平, 应用ROC曲线分析其用于结直肠癌诊断时的灵敏度为75.3%, 特异度为88.3%, AUC为0.863, 差异有统计学意义(P＜0.01)；CRC两亚组间比较亦有显著差异, 鉴别肝转移性与无转移性结直肠癌患者的敏感性为78.6%, 特异性为86.6%, AUC为0.896。本研究结果提示血清miR-92a作为结直肠癌的生物学标志物有一定的准确性和可行性, 能有效区分健康人和CRC患者,可鉴别诊断肝转移性与无转移性的结直肠癌, 其表达水平上调与CRC患者的预后有关, 与熊青等［8］报道一致。然而,本实验病例数尚少, 且血清中miRNA浓度低, PCR反应所需循环次数多, 持续时间较长, miRNA检测方法的标准化和标准化的miRNA诊断阈值的确定以及组织特异miRNA的确定等仍是血清miRNA诊断应用中的难题, 不能排除抽样误差,故血清miR-92a能否成为结直肠癌诊断和预后的新的生物学标记物, 可进一步扩大样本量探究。

［1］ 孙燕.临床肿瘤学高级教程.北京：人民军医出版社, 2011: 531-550.

［2］ Babashah S, Soleimani M.The oncogenic and tumour suppressive roles of microRNAs in cancer and apoptosis.Eur J Cancer, 2011, 47(8):1127-1137.

［3］ 徐怡, 陈光明, 宓现强.miRNA在肿瘤早期诊断中的价值及其检测技术进展.检验医学, 2013, 28(3):248-251.

［4］ 刘寒梢, 马越云, 肖华胜.血清微小RNA(miR-129-3p、miR-767-3p和miR-877*)在结直肠癌诊断中的价值.肿瘤, 2012, 32(1):42-48.

［5］ Catuogno S, Cerchia L, Romano G, et al.miR-34c may protect lung cancer cells from paclitaxel-induced apoptosis.Oncogene, 2013, 32(3):341-351.

［6］ Maitra A, Hruban RH.Pancreatic cancer.Annu Rev Pathol, 2008(3):157-188.

［7］ 奉林, 庞智, 沙莎, 等.结直肠癌患者血清miR-29a水平测定的临床意义.航空航天医学杂志, 2012, 23(12):1414-1416.

［8］ 熊青, 徐龙.血清microRNAs在胃肠道疾病中的意义.世界华人消化杂志, 2012, 20(22):2043-2049.

Clinical significance of serum miR-92a in colorectal cancer patients

QIU Jun-lan, FENG Lin.
Department of Oncology, North District of Suzhou Municipal Hospital, Suzhou 215008, China

ObjectiveTo investigate the value of serum miR-92a in the diagnosis and prognosis prediction of colorectal cancer (CRC).MethodsA total of 78 cases of CRC were divided into non-metastasis group (n=40) and liver metastasis group (n=38), and 40 healthy volunteers were put into health control group.The level of miR-92a was detected by real-time RT-PCR.ResultsThe level of serum miR-92a was significantly higher in CRC patients than in the control group (P＜0.01).The sensitivity was 75.3% and the specificity was 88.3% in discriminating CRC.The liver metastasis group had higher level of serum miR-92a than the nonmetastasis group, (P＜0.05).The sensitivity was 78.6% and the specificity was 86.6% in discriminating metastatic or non-metastatic CRC.ConclusionSerum miR-92a can become a new biomarker for early diagnosis of CRC patients, and its level is associated with prognosis of CRC patients.

Colorectal cancer; Serum; MicroRNA; Biomarker

2014-07-08］

215008 苏州市立医院北区肿瘤内科