紫外分光光度法测定犬血浆中美沙拉嗪的药物浓度

牛青梅 周庆颂 孙若飞

紫外分光光度法测定犬血浆中美沙拉嗪的药物浓度

牛青梅 周庆颂 孙若飞

目的建立测定犬血浆中美沙拉嗪浓度的紫外分光光度法(UV)。方法以5%三氯乙酸沉淀蛋白, 在紫外吸收波长303 nm处测定吸光度值。结果回归方程为Y=0.0051X+0.0277(r=0.9997),线性范围40～160 µg/ml；美沙拉嗪低、中、高3种浓度方法回收率分别为(97.16±2.37)%、(98.92±1.84)%、(98.41±2.29)%；日内精密度RSD分别为2.17%、1.75%、2.21%, 日间精密度RSD分别为1.88%、1.68%、1.63%。结论紫外分光光度法简单、准确、成本低, 为后续开展相关研究奠定了基础。

紫外分光光度法；血药浓度；美沙拉嗪

美沙拉嗪(5-ASA)是治疗溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和节段性回肠炎(克罗氏病, crohn's disease, CD)的主要药物之一［1］。目前美沙拉嗪血药浓度测定方法基本是采用高效液相色谱法(HPLC), 但是HPLC法测定5-ASA血药浓度的方法前处理复杂, 对仪器要求较高, 而一些体外药物代谢动力学实验, 如血浆蛋白结合率测定、离体(或在体)肠吸收实验等采用HPLC法进行药物浓度测定非常不便。作者采用UV法, 以5%三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白后建立了测定犬血浆中5-ASA浓度的方法。该方法具有专属性强、血浆用量少、准确、快捷方便等特点, 适用于一些体外药物代谢动力学试验中5-ASA药物浓度的测定。

1 材料与方法

1.1材料 UV-2550紫外分光光度计(日本岛津)；XS205 Dualrange电子天平(瑞士METTLER, 精度十万分之一)；Vortex Genie2 涡旋振荡器(美国Scientific Industries公司)；ANKE TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；5-ASA对照品(上海金锦乐股份有限公司, 纯度＞98%), 犬血浆(北京平睿生物科技有限公司), 三氯乙酸(天津大茂化学试剂厂, 纯度＞99%), 其他试剂均为分析纯, 实验用水为双蒸水。

1.2方法

1.2.1美沙拉嗪系列标准溶液配制

1.2.1.1pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)的配制 精密称取磷酸氢二钾14.11 g, 磷酸二氢钾2.59 g, 氯化钠1.99 g, 定容至1000 ml即得。

1.2.1.2系列标准溶液配制 精密称取5-ASA对照品160 mg, 置于100 ml量瓶中, 用PBS缓冲液稀释至刻度, 得质量浓度为1.60 mg/ml的标准贮备液。分别用PBS缓冲液稀释配制成0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/ml的标准系列溶液,冷藏保存。

1.2.2血浆样品处理 精密吸取血浆样品800 µl, 置5 ml离心管中, 加入PBS缓冲液, 旋涡混合30 s后加入蛋白沉淀剂(5%三氯乙酸溶液)800 µl, 旋混1 min, 10000 r/min离心15 min, 取上清液, 经0.45 µm微孔滤膜过滤后取续滤液, 即得。

1.2.3方法专属性及测定波长的选择 取空白血浆、含药(5-ASA)血浆分别经“1.2.2”项方法处理后对其进行紫外光谱全扫描, 结果见图1。光谱对比表明血浆中内源性物质在检测波长303 nm处无干扰, 专属性良好, 因此选择303 nm作为测定波长。

图1 血浆样品UV扫描图谱(A含药血浆；B空白血浆)

1.2.4标准曲线的制备 精密吸取空白血浆800 µl, 置5 ml离心管中, 分别加入“1.2.1”项下制备的不同质量浓度的5-ASA系列标准溶液80 µl, 旋涡混合30 s, 得到含5-ASA浓度分别为40、60、80、100、120、140、160 µg/ml的血浆样品。按“1.2.2”项下方法处理；同时取空白血浆800 µl, 加入80 µl PBS缓冲液, 同法处理作为空白；按照UV法［1］, 在303 nm波长处测定吸光度, 以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.5方法回收率与精密度 分别于800 µl的空白血浆中加入低、中、高3种浓度(600、1000、1400 µg/ml)的5-ASA对照品溶液80 µl, 混匀, 得低、中、高3种不同浓度美沙拉嗪的血浆样品, 按“1.2.4”项下方法处理并测定, 将5-ASA的吸光度值代入标准曲线计算5-ASA 血药浓度, 以测得值与加入值之比计算方法回收率。以1 d内测得的5-ASA浓度计算日内精密度, 以1周内5次测定的5-ASA浓度计算日间精密度。

1.3统计学方法 采用 DAS2.0药物代谢动力学软件进行统计分析。相关结果比较采用回归分析。

2 结果

2.1标准曲线方程 标准曲线试验数据如表1所示, 回归方程为：Y=0.0051X+0.0277, 相关系数r=0.9997, 美沙拉嗪在40～160 µg/ml范围内线性关系良好。

2.2回收率及日内精密度 回收率及日内精密度试验结果如表2所示。低、中、高3种质量浓度的平均方法回收率分别为(97.16±2.37)%、(98.92±1.84)%、(98.41±2.29)%(n = 6)。低、中、高3 种质量浓度的日内RSD分别为2.17%、1.75%、2.21%。

2.3日间精密度试验 1周内连续5个工作日测定所得日间精密度, 结果如表3所示。低、中、高3 种质量浓度的日间RSD分别为1.88%、1.68%、1.63%。

表1不同浓度美沙拉嗪血浆UV测定结果(n=3)

表2回收率及日内精密度试验结果(n=6)

表3日间精密度试验结果(n=6, d=5)

3 讨论

本试验选取5%三氯乙酸溶液直接沉淀蛋白的方法测定5-ASA 血药浓度。该方法简化了样品预处理过程, 可在短时间内处理大批样品, 具有简便迅速, 蛋白清除完全, 灵敏度及回收率高的特点。由于三氯乙酸的酸性较大, 加入后使5-ASA吸收波长蓝移, 其最大吸收波长由330 nm变为303 nm。测定过程中作者采用空白血浆按含药血浆相同方法进行处理作为空白对照, 能有效去除血浆中内源性物质对测定的干扰［3］。本试验所得标准曲线线性范围为40～160 µg/ml, 基本能够满足大部分体外药物代谢动力学试验的测定需要。

［1］ 刘伟.溃疡性结肠炎的药物治疗现状与前景.国外医学(消化系疾病分册), 2003, 23(5):261-263.

［2］ 国家药典委员会.中国药典(二部).北京: 中国医药科技出版社, 2010:30-31.

［3］ 熊凤英, 简洁, 周淑群, 等.紫外分光光度法测定米非司酮血药浓度.中国医院药学杂志, 2008, 18(6):262-263.

The Determination of mesalazine in dog plasma by UV-spectrophotometry

NIU Qing-mei, ZHOU Qingsong, SUN Ruo-fei.
School of Pharmacy, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China

ObjectiveTo establish UV-spectrophotometry (UV) method for the determination of mesalazine in dog plasma.MethodsSerum protein was precipitated with 5% trichloroacetic acid, and the absorbance value at 303 nm was detected.ResultsThe regression equation was Y=0.0051 X+0.0277 (r=0.9997), and the linear response range was 40～160 μg/ml.The recovery rates of mesalazine in three different concentrations were (97.16±2.37)%, (98.92±1.84)%, (98.41±2.29)% respectively.The RSD of intra-day precision was 2.17 %, 1.75%, 2.21%.The RSD of inter-day precision was 1.88 %, 1.68 %, 1.63 % respectively.ConclusionThe UV method is simple, accurate and low-cost, which can lay the foundation for the further research.

UV-spectrophotometry; Blood concentration; Mesalazine

2014-08-08］

国家自然科学基金项目(项目编号：81160397)

330013 江西科技师范大学药学院

周庆颂