人支气管上皮细胞中苯并芘诱导TNF-α表达的分子机制

代佳，吕建祎，张敏，蔡秦真，高基民

（浙江省模式生物技术与应用重点实验室，温州医科大学 检验医学院 生命科学学院，浙江 温州325035）

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是TNF超家族中的一员，主要是由单核巨噬细胞、淋巴细胞产生的细胞因子。同时，多种肿瘤细胞（肺癌细胞、B淋巴细胞瘤、乳腺癌和结肠癌等）[1]也均可检测到其表达。TNF-α是炎症反应中出现最早、最重要的炎性递质之一，与其受体TNFR（TNF-R1、TNF-R2）结合后，通过激活NF-κB、JNK和MAPK信号通路[2]，可调节细胞炎性和其他细胞反应。而且越来越多的研究显示，TNF-α可以通过促进细胞增殖，血管生成和调节新陈代谢，促进肿瘤的发生与发展[3-5]。在全球，肺癌的发病率和病死率均居癌症之首。研究[6]显示90%的肺癌与吸烟相关。香烟中含有的苯并芘（B[a]P）及其代谢产物B[a]PDE是烟草中最重要、最强有力的肺致癌物质[7]。B[a]P及B[a]PDE在慢性肺炎及肺部肿瘤的形成过程中发挥重要作用，而肺部炎症的持续存在与肺癌的形成之间存在着紧密联系[8-9]。

我们在人支气管上皮细胞（Beas-2B）中研究了B[a]P对炎症因子TNF-α mRNA表达的调控机制。已有研究表明，TNF-α基因调节序列中包含转录因子NF-κ B和AP1的结合序列[10-11]，说明了TNF-α转录调节的复杂性。实验中将不同长度片段的TNF-α基因启动子序列成功克隆入psiCHECK-2载体荧光素酶报告基因上游。并且发现24 h内，B[a]P能够通过促进TNF-α mRNA的转录从而促进TNF-α mRNA的表达，为以后更深一步地研究TNF-α在B[a]P诱导肺慢性炎症至肺癌的发生发展中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验细胞 Beas-2B细胞由纽约大学黄传书教授惠赠。

1.2 材料 B[a]P（Sigma）；DMEM培养基和FBS（GIBCO公司）；psiCHECK-2载体（上海吉玛公司）；DH5α菌株（实验室保存）；Trizol（Invitrogen公司）；反转录试剂盒（大连宝生物工程公司）；Power SYBR® Green PCR Master Mix（Applied Biosystems公司）；Dual-luciferase reporter Kit（Promega公司）；Lipofectamine® 2000 Reagent（Invitrogen公司）；T4 DNA连接酶、细胞基因组DNA提取试剂盒、PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase、DL 2 000 DNA Marker、DL 10 000 DNA Marker、限制性内切酶XholI、NotI均购自大连宝生物工程公司；Plasmid Miniprep Kit（天根生化科技有限公司）；Gel Extration Kit（上海捷瑞生物工程有限公司）；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 Beas-2B细胞中TNF-α mRNA表达量的检测：将Beas-2B细胞种于6孔板中，8 μ mol/L B[a]P处理不同的时间后，收集细胞，加入Trizol提取细胞总的RNA，将提取好的RNA在NANO DROP 2000仪器上测定其RNA浓度，且A260/A280为1.9～2.1。按照反转录试剂盒的使用说明进行反转录反应，Real time-PCR检测其中TNF-α mRNA水平随B[a]P处理时间不同表达量的变化。Real Time-PCR所用引物见表1。

1.3.2 引物设计及其合成：自UCSC Genome Browser网站数据库检索获得TNF-α启动子序列（见图1），分别设计2段启动子引物序列（见表2）。结合载体单克隆位点上的限制性内切酶位点和这2段启动子序列的碱基情况，在上游引物5'端加入XholI的酶切位点CTCGAG，在下游引物5'端加入NotI的酶切位点GCGGCCGC。从转录起始零点开始，2段启动子片段长度分别为：-2 000～+186（2 186 bp）和-1 000～+186（1 186 bp）。

表1 Real Time-PCR所用引物

图1 人TNF-α基因启动子DNA序列

表2 构建人TNF-α基因启动子区报告基因质粒所用引物

1.3.3 TNF-α启动子基因的克隆：以Beas-2B细胞中提取的基因组DNA为模板，以UCSC网站获得的TNF-α启动子序列设计的引物，采用高保真酶Prime-STAR® GXL DNA Polymerase进行PCR扩增。PCR反应体系为20 μL：PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.4 μL，5×PrimeSTAR GXL Buffer（Mg2+Plus）4 μL，dNTP Mixture 1.6 μL，模板1 μL，分别取上游引物F1、F2和下游引物R各0.5 μL，加ddH2O至总体积20 μL。反应条件：98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，56 ℃ 2 min，30个循环。反应结束后，取2 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测目的片段扩增结果，剩余的PCR产物进行胶回收，得到2段不同长度（2 186 bp和1 186 bp）的TNF-α基因启动子片段。

1.3.4 TNF-α启动子载体的构建与测序：采用XhoI、NotI这2种限制性内切酶对目的DNA片段和荧光素酶报告基因psiCHECK-2载体进行37 ℃双酶切5 h，酶切产物全部进行1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的片段。回收的酶切产物用Nano Drop 2000测定其DNA浓度，按照目的基因与载体摩尔比1∶1的比例，在T4连接酶的作用下，于16 ℃连接12 h。连接产物以低温CaCl2法转化E.coli DH5α感受态细胞，涂于含50 mg/L氨苄青霉素的固体LB培养皿上，37 ℃培养12 h后挑取单克隆菌落，摇菌后用质粒小提试剂盒提取质粒，提取的质粒用Xhol、NotI进行双酶切鉴定。同时，将提取的质粒送华大基因公司进行测序。

1.3.5 TNF-α启动子载体转染Beas-2B细胞：将构建成功的2种重组质粒psiCHECK-2-TNF-α-promoter1、psiCHECK-2-TNF-α-promoter2和空载体psiCHECK-2质粒做转化提取质粒，Nano Drop 2000测定质粒浓度。将Beas-2B细胞种于24孔板，按照Lipofectamine®2000脂质体转染试剂说明，当细胞密度达到80%时进行转染实验。每孔分别定量加入psiCHECK-2-TNF-αpromoter1、psicheck2-TNF-α-promoter2质粒和空载体psiCHECK-2质粒0.8 μg、Lipofectamine® 2000 2 μL和无血清培养基100 μL。6 h后换含10% FBS、1%双抗的DMEM培养基，37 ℃、5% CO2培养箱培养。

1.3.6 报告基因活性的检测：瞬时转染48 h后收集细胞，每个样本分3个复孔，每孔加75 μL的细胞悬液，再加入75 μL的Dual-Glo® Luciferase Reagent，混匀。25 ℃孵育10 min，待细胞充分裂解后，酶标仪测量萤火虫荧光值（Firefly Luc）。再向每孔中加入75 μL的Dual-Glo® Stop&Glo® Reagent，混匀。25 ℃孵育10 min，酶标仪测量海肾荧光值（Renilla Luc）。计算Firefly Luc/Renilla Luc的比值，并以空载体psiCHECK-2转染细胞作对照，以判断promoter1[psiCHECK-2-TNF-α-promoter1（2 186 bp）]和promoter2[psiCHECK-2-TNF-α-promoter2（1 186 bp）]2种启动子的活性。

1.3.7 在B[a]P处理下TNF-α启动子活性的检测：Beas-2B细胞和293T细胞瞬时转染psiCHECK-2-TNF-α-promoter1、psiCHECK-2-TNF-α-promoter2重组质粒和空载体psiCHECK-2后，用含1% FBS、1%双抗的DMEM培养基饥饿细胞12 h，加B[a]P刺激细胞不同时间长度（0、12和24 h）。收集细胞检测其荧光数值，计算Firefly Luc/Renilla Luc的比值，统计B[a]P刺激下其启动子活性的变化。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件进行分析。组内差异采用单因素方差分析，组间差异分析采用双因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 B[a]P对TNF-α mRNA表达的影响 24 h内，8 μmol/LB[a]P暴露下，Real time-PCR检测Beas-2B细胞中的TNF-α mRNA的表达量呈升高趋势（见图2）。

图2 8 μmol/L B[a]P暴露对TNF-α mRNA表达量的影响

2.2 TNF-α启动子序列克隆 以Beas-2B细胞中提取的基因组DNA为模板，设计TNF-α不同位点的引物序列，进行PCR扩增，得到2段不同长度的TNF-α启动子片段2 186 bp和1 186 bp（见图3）。

图3 TNF-α启动子序列PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图

2.3 TNF-α启动子双荧光素酶载体双酶切鉴定及测序 将目的DNA片段和空载体psiCHECK-2（见图4）进行XhoI、NotI双酶切后，胶回收得到相应的条带，在T4连接酶连接后转化E.coli DH5α感受态细胞。提取的质粒再经XhoI、NotI双酶切鉴定，2个重组质粒分别释放出2 186 bp和1 186 bp大小的DNA片段（见图5）。华大基因测序比对测序结果证实2个质粒包含2段相应长短的TNF-α启动子序列，测序鉴定正确。

图4 psiCHECK-2载体图谱

TNF-α启动子重组质粒：promoter1[psiCHECK-2-TNF-α-promoter1（2 186 bp）]和promoter2[psiCHECK-2-TNF-α-promoter2（1 186 bp）]重组质粒构建成功。

图5 重组质粒双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图

2.4 TNF-α启动子活性的检测 将2个重组荧光素酶报告质粒分别转染到Beas-2B细胞中，检测发现与对照质粒相比，2个重组质粒的荧光素酶活性均相对较高，表明2段启动子序列均具有转录活性。而且，promoter1具有较高的启动子活性。说明，2段序列均包含有TNF-α的启动子部分（见图6）。

图6 TNF-α启动子活性检测

2.5 B[a]P对TNF-α启动子活性的影响 荧光素活性检测结果显示，B[a]P暴露下，24 h内，Beas-2B细胞中重组质粒的荧光素活性呈升高趋势（见图7）。同时，在293T细胞中，B[a]P刺激也可以使重组质粒的荧光素活性升高（见图8）。由此可以得知，B[a]P能够促进TNF-α mRNA的转录，promoter2活性比promoter1强，且没有细胞特异型。

图7 8 μ mol/L B[a]P暴露对Beas-2B细胞中TNF-α启动子活性的影响

图8 8 μmol/L B[a]P暴露对293T细胞中TNF-α启动子活性的影响

3 讨论

150年前，Virchow最初发现慢性炎症和肿瘤之间存在着关联[12]。大量研究证实，慢性炎症是肿瘤发生的一个重要的原因。炎症微环境促进细胞转化，例如HBV病毒引起肝炎、肝硬化，最终发展为肝癌[13]；幽门螺旋杆菌引起胃炎、胃溃疡，最终发展为胃癌[14]；HPV病毒引起宫颈炎、宫颈糜烂，最终发展为宫颈癌等[15]。

在肿瘤微环境中，TNF-α的持续产生是多种恶性肿瘤发生的标志。同时，也可以作为肿瘤的预后指标[1]。如果组织中TNF-α表达水平较高，则表示预后不良。由于TNF-α可通过与其受体TNFR结合发挥作用，且TNF-α受体能在上皮细胞和基质细胞中表达。因此，TNF-α可以通过调节肿瘤细胞的增殖及存活直接促进肿瘤的发生发展。同时，TNF-α也可以通过影响肿瘤微环境中的上皮细胞和其他炎症细胞，间接促进肿瘤的发生发展。另外，肿瘤基质细胞（包括巨噬细胞、树突状细胞和成纤维细胞）可以分泌多种炎症因子（如TNF-α、IL-1和IL-6），这些细胞因子攻击和招募更多的炎性细胞到达肿瘤微环境，增强其增殖及存活能力。

已有的研究表明，TNF-α参与肿瘤发生发展的各个进程[16]。首先，TNF-α可以诱导肿瘤的发生发展。一方面，TNF-α或TNF-α受体缺陷的小鼠对化学药物诱导的皮肤癌的敏感性降低，而且很少发生转移。在TNF-α基因缺陷的小鼠中，冈田酸和佛波酯也很难诱导皮肤癌的的发生。从以上可以看出，TNF-α的缺陷减缓了肿瘤的发生发展[17]。另一方面，TNF-α可以通过激活NF-κB、PKCα和AP-1信号通路，从而诱导肿瘤的发生发展。在小鼠上皮JB6细胞中，TNF-α可以使NF-κB活性增强（以剂量依赖的方式），这在细胞恶变的过程中起着非常重要的作用[18]。其次，TNF-α可以增强肿瘤细胞的增殖能力。TNF-α作为一个诱变剂，可以增强肿瘤细胞的增殖及存活。TNF-α可以通过激活NF-κB，从而促进细胞的存活及增殖，也可以通过编码NF-κB依赖的抗凋亡分子的生成，从而促进肿瘤细胞的存活[19]。另外，TNF-α不仅是一个自分泌生长因子，也可以诱导其他生长因子的表达（如EGFR和TNF-α），从而促进肿瘤细胞的增殖。第三，TNF-α能够促进肿瘤血管的生成。它可以通过调节多种血管生成因子，如IL-8、VEGF的表达，从而介导血管的形成。TNF-α也可以通过调控JNK和AP-1通路调节VEGF的表达[20]。另外，使用TNF-α的多克隆抗体可以完全中和TNF-α促进血管生成的作用[21]。最后，TNF-α可以促进肿瘤细胞的侵袭和转化。在巨噬细胞中，TNF-α通过上调迁移抑制因子（MIF）诱NF-κ B和JNK信号通路的激活，促进肿瘤的侵袭[22]。在肿瘤细胞中，TNF-α通过诱导MMPs和MMPsα/2β1整合蛋白的产生，从而增强肿瘤细胞的侵袭能力。在纤维肉瘤组织中，TNF-α可以促进肿瘤的肺转移[23]。在一些肿瘤细胞中，TNF-α可以通过NF-κB依赖的方式诱导趋化因子受体CXCR4、化学诱变蛋白MCP-1、IL-8和细胞内黏附分子-1的产生，从而增强细胞的迁移和转化[24-25]。因此，TNF-α可以通过其对肿瘤细胞、基质细胞以及肿瘤微环境中的炎症细胞的影响，从而促进肿瘤转移。

大量研究报道，在非小细胞肺癌中，TNF-α在鳞癌和腺癌中的阳性表达率均较高[26-27]，说明在非小细胞肺癌的发生发展过程中，TNF-α作为一种重要的细胞因子参与，并发挥着重要作用。由于炎症环境能够促进肿瘤细胞的侵袭和转移，因此炎症的持续存在与癌症的形成之间存在密切联系。慢性间质浸润性肺部疾病包括各种各样的疾病，通常从肺泡炎和/或细支气管炎开始[28]。在粉尘诱发肺癌动物模型中，在晶体硅刺激下首先导致炎性肉芽肿的形成，之后 II型肺细胞和细支气管上皮细胞开始增生，后期腺瘤出现并最终导致腺癌或鳞状细胞癌，证实炎症与肺部肿瘤的发生有直接联系[29]。研究证实，在A/J小鼠模型中，反复的B[a]P刺激可能导致肺部慢性炎症，从而增加肿瘤的发生率[30]。

有研究报道，在Beas-2B细胞中，环境中的有毒物质镍可以通过调控TNF-α的启动子活性从而诱导其表达，增加了肺癌发生的风险性[31]。同时，还有研究显示，在小鼠表皮Cl41细胞中，香烟中B[a]P的代谢产物B[a]PDE可以诱导TNF-α的表达，参与了小鼠皮肤癌的发生，并在其癌症的进展过程中也起着非常重要的作用[32]。

NF-κB是TNF-α信号通路中重要的信号分子，并在多种疾病的发生发展过程中起着重要作用，如：癌症、哮喘、肌营养不良等。TNF可以通过IKK激酶复合体使IκBα蛋白的Ser32和Ser36或IκBβ蛋白的Ser19和Ser23 2个位点磷酸化，磷酸化的IκBα和IκBβ中的Lys21、Lys22泛素化，然后被S26蛋白酶复合体识别并迅速降解，使得NF-κ B的NLS暴露，进入核内起始转录，诱导多种凋亡抑制因子的表达[33]。因此可以得出，TNF在调控NF-κ B信号通路过程中起着重要的作用，进而影响了细胞的生存、增殖、分化以及死亡等细胞的多种生理病理性过程。

此项研究中，我们发现在B[a]P暴露下，24 h内，Beas-2B细胞中TNF-α的mRNA表达量呈升高趋势，并对其调节机制进行了初步探索。以Beas-2B细胞基因组为模板，构建了包含不同长度片段的TNF-α启动子序列的双荧光素报告基因质粒，成功检测到Beas-2B细胞中启动子的表达。而且，用8 μmol/L B[a]P处理转染了2个重组荧光素报告基因质粒的Beas-2B细胞后，24 h内，2个重组质粒的荧光素活性呈升高趋势。为了证明B[a]P刺激细胞引起的这种变化有没有细胞特异性，我们将重组质粒又转染了293T细胞，结果发现，B[a]P作用于293T细胞后，2个重组质粒的荧光素活性也会升高，说明没有细胞特异性。由此可以得知，B[a]P能够促进TNF-α mRNA的转录从而促进TNF-α mRNA的表达，且promoter1要比promoter2活性强。这为以后更深一步地研究肺癌组织中TNF-α与各个炎症因子之间的相互关系及其调控机制提供了有力的研究工具。