白色念珠菌TOR信号转导通路研究现状

梁华军，阎 澜，曹永兵，姜远英，颜天华 (．中国药科大学药学院，江苏 南京 0009；.第二军医大学药学院新药研究中心，上海 00433)

雷帕霉素(rapamycin)又名西罗莫司(sirolimus)，是20世纪70年代从链球菌属微生物吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)中分离得到的大环内酯类次级代谢产物[1]，最初用于治疗白色念珠菌(Candidaalbicans)引起的感染，但由于其作用无选择性，在杀死白色念珠菌的同时也能伤害到宿主正常细胞，故其应用受限。近年来研究表明,雷帕霉素具有免疫抑制活性，现在多联合用药治疗肿瘤或器官移植[2]。

雷帕霉素靶(TOR)蛋白是在研究雷帕霉素抗细胞过度增殖过程中发现的。真核细胞中，雷帕霉素与一个相对分子质量为12 000的小分子蛋白FKBP12结合，TOR蛋白是两者结合后的作用靶点[3]。 Heitman等[4]在分析不同酿酒酵母突变菌株对雷帕霉素敏感性差别时发现，TOR蛋白具有两个同系物TOR1p和TOR2p，随后在人类细胞中也发现了这两个同源蛋白的存在。研究证明，TOR1蛋白是rapamycin-FKBP12复合物的作用靶点。但也有例外，在布氏锥虫(Trypanosomabrucei)中，与rapamycin-FKBP12复合物结合的是TOR2蛋白。

近30年来，随着癌症放化疗、器官移植和艾滋病患者人数的增加、广谱抗生素及免疫抑制剂的大量使用，静脉导管植入及腔内支架的普及应用，深部真菌病，尤其是白色念珠菌所致的深部真菌感染发病率逐年增加[5]。氟康唑因其具有良好的生物利用度和较少的不良反应成为目前临床应用最广泛的抗系统性真菌感染的药物；但由于其仅具有抑菌作用，故在长期治疗和重复给药过程中产生了快速发展的耐药性。在我国，虽然因观察时间、菌株来源以及地域不同，白色念珠菌的耐药率从14.1%～84.2%不等，但近年来白色念珠菌耐药性呈明显的上升趋势[6-8]。抗真菌药物种类有限及对抗真菌的耐药性问题已成为临床白色念珠菌感染治疗失败的最主要原因，不仅造成患者痛苦，也消耗了大量社会医疗资源，使真菌病防治面临更为严峻的挑战。因此，研发针对白色念珠菌的高效且低耐药性的药物非常重要。TOR通路参与调控白色念珠菌细胞生长、菌丝形成，而酵母态与菌丝态的转变既参与调控细胞的生长周期，又与白色念珠菌致病力、毒力密切相关。因此，TOR通路相关蛋白是潜在的抗真菌药物新靶标。

1 白色念珠菌TOR信号通路结构

1.1TOR蛋白结构 TOR蛋白高度保守，白色念珠菌TOR蛋白结构与酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)结构类似。酿酒酵母TOR蛋白三级结构如图，其中FRB(FKBP12-Rap binding domain)是rapamycin-FKBP12复合物与TOR蛋白结合的重要区域。当FRB被雷帕霉素结合后，分子中的激酶活性域(kinase domain)无法暴露，TOR蛋白激酶便不能发挥功能。

图1 TOR蛋白三级结构示意图[9]

酿酒酵母TOR蛋白在TOR信号通路中存在两种复合物，TORC1(TOR complex 1)和TORC2(TOR complex 2)。TORC1主要影响细胞瞬时生长，与营养、应激、核糖体的合成等有关，通常对雷帕霉素敏感；而TORC2主要调节细胞骨架的运动能力，通常对雷帕霉素不敏感。酿酒酵母TORC1和TORC2的结构组成如图2。

图2 酿酒酵母TOR通路中复合物TORC1和TORC2的组成及作用示意图[10]

根据同源性预测，构成白色念珠菌TORC1的组分有TOR1p、Tco89p、Kog1p、Lst8p。其中，Tco89p参与调节细胞完整性，Kog1p参与调节生长，Lst8p[11]与白色念珠菌对雷帕霉素敏感性有关。白色念珠菌中目前未发现TOR2蛋白存在。酿酒酵母TORC2包括TOR1p、Avo1p、Avo2p、Avo3p和Lst8p。其中，白色念珠菌Tsc11p是酿酒酵母菌Avo3p同源蛋白[12]，与鞘脂(sphingolipid)生物合成有关；而白色念珠菌中与Avo1p、Avo2p的同源蛋白功能暂未明确。

1.2TOR信号通路上游组成 酿酒酵母TOR信号通路上游存在一条路径：VAM6-EGOC-TORC1。复合物EGOC(exit from growth arrest complex)位于TORC1上游，由Gtr1p、Gtr2p、Ego1p、Ego3p组成，调节细胞自噬、氨基酸转运通透酶Gap1p的活性。如果缺失EGOC会导致液泡酸化缺陷。Binda 等[13]发现，酿酒酵母Rag GTP酶类似物Gtr1p，作为与液泡膜相关的EGOC的一个组成部分，以对亮氨酸、组氨酸敏感的方式激活TORC1。Gtr1GTP持续过表达，可部分缓解TORC1由于亮氨酸缺乏引起的功能抑制；而激活Gtr1GDP 引起TORC1活性的持续降低；Gtr1p与GTP或GDP结合状态由鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)Vam6p调节。

Zakikhany等[14]推测白色念珠菌 Gtr1p 是GTP结合蛋白，该蛋白在艾滋病患者口腔中分离得到的白色念珠菌中表达升高， 其作用机制有待进一步分析证明。白色念珠菌Gtr2p与酵母Gtr2p蛋白同源，与自噬相关，正向调节RNA聚合酶Ⅱ(RNA polⅡ)启动子。白色念珠菌中并未鉴定出与酵母Ego1p、Ego3p同源的蛋白。白色念珠菌Vam6p可能与酵母Vam6p类似，也参与氨基酸转运，维持液泡功能完整性，这有待进一步的研究证明。

Tsao等[15]发现白色念珠菌TOR通路上游的另一个信号转导途径：TSC2-RHB1-TOR。Rhebp是真核细胞中Ras超家族中一个新发现的小分子G蛋白，参与调控多种生理过程，其活性受到GAP蛋白Tsc2p的调节。研究发现，Rheb即为Rhb1p，敲除RHB1基因，白色念珠菌对雷帕霉素的敏感性升高，表明Rhb1p与TOR信号通路相关；进一步研究发现，Rhb1p通过对铵盐通透酶Mep2p氮源传感器的调控，参与调节菌丝形成。另外，Rhb1p通过TOR激酶和Mkc1-MAP激酶通路调节细胞壁完整性。

1.3TOR信号通路下游组成 白色念珠菌中，已经证实的TOR信号通路作用底物有Sit4p，Mds3p。Lucia等[16]证明Mds3p调节依赖pH的形态变化，参与酵母态到菌丝态的转变，以及染色体与生物被膜形成等过程。MDS3基因敲除菌的TOR信号通路过度激活，核糖体蛋白的优先合成以及调控氮源利用的基因表达下调；MDS3基因缺失菌引起的菌丝形成缺陷、转录缺陷均可被雷帕霉素恢复。同样，SIT4基因缺失菌引起的菌丝形成转录缺陷也可被雷帕霉素恢复。而带有TOR1-1等位基因和RBP1缺失菌中，这些缺陷不能被雷帕霉素恢复。Mds3p和Sit4p能免疫共沉淀，而Sit4p已经是TOR信号通路的一个效应器[17]，表明Mds3p是TOR通路下游的一个新成员。

Gln3是白色念珠菌TOR信号通路下游另一个组成部分[18]。Gln3p编码的GATA因子，与白色念珠菌的氮代谢有关。GLN3基因缺失菌在特定的氮源存在时的生长率明显降低，同时缺失GLN3和GAT1时，菌株生长缺陷更严重。Gln3p可激活铵盐代谢相关基因GDH3和MEP2，而与氮源代谢相关的 GAT1只参与MEP2的表达，而不是GDH3。另外，GLN3和GAT1也可激活编码氨基酸通透酶的GAP2基因，并且GLN3对它的激活是氮源依赖性的。GLN3基因缺失时，Gat1p活性下降50.0%～66.7%。GLN3和GAT1分别缺失时，菌株对雷帕霉素的敏感降低，对菌丝形成缺陷的影响也与氮源相关。

酵母Sch9p是TORC1的直接作用底物[19]。Liu等[20]研究表明，Sch9基因敲除后，白色念珠菌细胞变小，延迟进入对数生长期，菌株对雷帕霉素、咖啡因、十二烷基磺酸钠(SDS)敏感，并且影响菌丝的形成，在全身感染小鼠模型中的毒力降低。

1.4TOR1p在细胞内定位 TOR1p在生物体内的定位多年来一直存在争议。TOR信号通路在细胞质内和细胞核内调控多种细胞进程，包括：氨基酸转运，核糖体RNAs合成，核糖体蛋白的表达。Li等[21]研究表明，TOR1p核内定位是营养依赖和雷帕霉素敏感的，营养缺陷和雷帕霉素处理引起TOR1p由核内外排至细胞质。研究还表明，TOR1p的核内定位对35 SrDNA的合成非常重要，但不影响氨基酸转运和核糖体蛋白的表达。Srugill等[22]通过TOR1-GFP证明了酿酒酵母TOR1p定位于液泡。哺乳动物TOR蛋白在有些报道中[23]也是在细胞质和细胞核内动态转运的。白色念珠菌TOR1p定位有待进一步明确。

2 白色念珠菌TOR信号通路的作用

2.1调控黏附基因表达 白色念珠菌的生物被膜在生物和非生物表面都可形成，如：组织、外科支架、牙托、导管等[24]，进而产生耐药性，加重病情。细胞间黏附作用是白色念珠菌生物被膜形成的关键因素。

真核细胞的生长与营养成分、生长因子、环境刺激相关，增强细胞间的联系，可以提高存活率。对雷帕霉素敏感的TOR1激酶，从酵母到人类细胞都高度保守，尤其在对细胞外营养的应答方面。Bastidas等[25]通过全基因组转录分析研究表明白念珠菌TOR1p除了调控与氮源缺乏应答和核糖体合成相关的基因外，还参与调节与细胞壁完整性、菌丝特异性相关的基因，包括抑制黏附与菌丝的诱导因子Bcr1p和Efg1p，以及激活黏附与菌丝的抑制因子Nrg1p、Tup1p。

被膜的形成依赖于黏附作用。ALS1、ALS3是ALS(agglutinin like sequence)家族中与被膜形成相关的基因。HWP1编码细胞壁甘露糖蛋白，与被膜形成相关。Tsuchimori等[26]证明白色念珠菌HWP1基因缺失后感染小鼠，小鼠死亡率显著降低，在感染小鼠的肾脏的过程中，白色念珠菌不易感染小鼠肾脏，并对上皮细胞损害降低，表明HWP1增强白色念珠菌黏附和毒力。被膜形成时，转录因子BCR1调控ALS1、ALS3、HWP1的表达[27]。另外，转录因子Tec1p，厚垣孢子，菌丝形成的转录抑制因子Nrg1p，Tup1p也参与黏附基因的表达调控，发挥抑制作用，并受TOR1p的调控，如图3。

图3 TOR通路调节黏附基因的示意图[25]

注：营养缺乏或用雷帕霉素处理时，TOR1p失活，直接或间接(虚线)下调转录抑制因子Nrg1p和Tup1p的表达，同时激活转录增强子Bcr1p和Efg1p，促进黏附相关基因表达，继而引起黏附和聚集

2.2影响氮代谢 位于TOR信号通路TORC1复合物下游的Gln3p、Gat1p参与白色念珠菌对氮源的代谢。白色念珠菌铵通透酶Mep2p是氮缺乏时的感受器，Gln3p可激动Mep2p。Liao等[14]通过敲除白色念珠菌GLN3和GAT1基因，分别供给不同氮源，以考察TOR通路调控下细胞生长状况。当优势氮源谷氨酰胺、铵、精氨酸、尿素存在时，亲本菌生长正常，而GLN3基因缺失菌的生长率降低了25%～40%；氮源为γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸盐、脯氨酸、异亮氨酸、色氨酸时，亲本菌生长略微缓慢，但GLN3基因缺失菌在以色氨酸为氮源时，生长率降低50%。与GLN3不同，在异亮氨酸和色氨酸作为唯一氮源时，GAT1基因缺失菌的生长率下降达80.0%～83.3%。

此外，GLN3基因缺失菌菌丝形成能力缺陷，其毒力和感染力降低，受感染BALB/c小鼠存活率显著延长，表明Gln3p可增强白色念珠菌致病力。

2.3参与核小体和核糖体蛋白的合成 核小体参与核糖体生物合成(ribosome biogenesis，Ribi)的转录输出，促进细胞生长，被高度控制。TOR激酶参与核小体和核糖体蛋白(ribosomal protein，RP)转录，RP在细胞生长方面有重要作用，消耗细胞内大部分能量，构建生命体骨架，当环境改变时，细胞必须迅速调整RP合成的平衡，以合理利用环境中的资源。酿酒酵母锌指蛋白Sfp1p是TORC1下游效应器，Sfp1p是调控Ribi和RP转录的激活因子[28]，但白色念珠菌中并不存在Sfp1p的同源蛋白。

TORC1另一个直接作用底物Sch9p也是Ribi和RP的一个激活因子，并且参与调控RNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ合成与功能。Sch9p被TOR1p磷酸化，从细胞质转移入细胞核内，参与Ribi和RP合成。Sch9p与Sfp1p在细胞内发挥平行作用，共同参与生物体的生长。在白色念珠菌中，Sch9p在低氧情况下，阻止菌丝的形成，而Sch9基因缺失菌并不影响到生长状况和抗逆能力，但在低氧情况下(<10% O2)却产生菌丝形成能力缺陷，这种缺陷可以在TOR1p被抑制的情况下恢复，雷帕霉素和咖啡因都可抑制TOR1p活性。故白色念珠菌中的TOR蛋白激酶参与Ribi和RP合成的机制有待进一步研究证明。

3 与TOR信号转导途径相关的通路

酿酒酵母与TOR信号转导途径相关的其他通路有[29-31]：钙调神经磷酸酶通路；GAAC通路，与氨基酸合成和利用相关；Snf1p通路，参与调节碳源的利用；逆反应通路，参与三羧酸循环的逆反应；PKC通路，与细胞壁完整性相关；PKA通路，参与核糖体蛋白合成，抑制应激反应和进入G0期；PHG通路，参与促进菌丝生长；自噬途径，发生自噬。

由上述可见，在白色念珠菌中也会存在许多与TOR通路相关的其他通路。通过这样的相互作用，可以放大TOR在生物体内的作用，也为TOR的研究提供了更多的方向和思路。

3.1与营养通路cAMP-PKA 雷帕霉素可以抑制TOR激酶，从而抑制RP合成，而RP在蛋白质的生物合成中起重要作用。TOR和cAMP-PKA都是营养通路，并且都可以在细胞周期G1期调控周期进程[32]。PKA在转录应答方面，作用显著，但许多基因需要PKA和TOR的共同调节才发挥正常作用，还有些与营养调节相关的基因既不需要PKA的参与，也不需要TOR的参与，而是靠葡萄糖转运途径参与生物体的营养应答。

3.2与pH通路Rim101 通过遗传学方法研究表明，Mds3p在白色念珠菌适应环境碱性pH方面作用重大。Mds3p表现出与Rim101平行应答于偏碱性(neutral-alkaline)pH的特性，已经研究成熟的Rim101在应答于环境pH的时候，Mds3p也发挥了重要作用，此种现象首先在酿酒酵母中发现。

4 展望

哺乳动物mTOR通路在癌症、错构瘤、移植排斥、自身免疫紊乱、心血管疾病、代谢紊乱治疗方面都有重要的作用。在果蝇，酵母以及粟酒裂殖酵母、盘状细胞黏菌、莱菌衣藻、布氏锥虫、拟南芥、秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇中也都展开了广泛研究[33]。TORC1的直接作用底物、TORC2的上游调节物质和直接作用底物都有待进一步发现和探索。条件致病菌白色念珠菌TOR信号通路参与氮源代谢，影响生长，并且参与调节黏附、菌丝形成，进而调节菌株致病力和毒力，对白色念珠菌TOR信号转导通路各分子及其相互作用关系的研究意义重大，为开拓新的抗真菌药物奠定理论基础。

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