水调散微生物限度检查的方法验证

何 进，任 雪，曹家辅，安 晔，刘瑞霞(.沈阳军区总医院药剂科，辽宁 沈阳006；. 沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳006)

水调散是沈阳军区总医院研制的制剂，是一种由黄柏、煅(石膏)为主要药味的外用散剂，具有清热解毒、消肿止痛的作用，用于未溃破的疮疖疔毒。按照《中华人民共和国药典(一部)》2010版附录相关规定[1]进行微生物限度检查，因许多药品本身具有抑菌性，对微生物的检测有干扰，因此在确定药品微生物限度检查方法时必须进行方法学验证，以确保在实际检验条件下药品微生物检测方法的准确性、有效性和重现性[2，3]。本实验对水调散的微生物限度检查方法进行了验证，为建立该制剂微生物限度检查方法提供依据。

1 实验材料

1.1药品和培养基 水调散(沈阳军区总医院，批号：20110107、20110210、20110321)；营养琼脂培养基(批号：110316)，营养肉汤培养基(批号：091008)，玫瑰红钠琼脂培养基(批号：110224)，改良马丁琼脂培养基(批号：100426)，胆盐乳糖(BL)培养基(批号：090517)，蛋白胨(批号：090712)，以上产品均购自北京三药科技开发公司。

1.2菌株 大肠杆菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(B)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(B)98003]、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]，均为第3代菌株，购自辽宁省药检所。

1.3仪器 ZF-Ⅰ型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)；NC303-4A电热恒温培养箱和NC303-4电热恒温培养箱(南京长江仪器厂)；YX280B手提式不锈钢消毒器(上海三申医疗器械有限公司)。

2 方法和结果

2.1pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液的制备 取磷酸二氢钾3.56 g、磷酸氢二钠7.23 g、氯化钠4.30 g、蛋白胨1.0 g，加水1 000 ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

2.2供试液的制备 取水调散10 g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，在45℃恒温水浴中保温震荡混匀，500 r/min离心3 min, 取其上清液作为1:10的供试液。

2.3菌液制备 分别取经35℃培养24 h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的新鲜培养物，以及经25℃培养48 h的白色念珠菌新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释成每1 ml含菌数50～100 CFU的菌悬液；取经25℃培养5 d的黑曲霉新鲜培养物，递增稀释成每1 ml含孢子数50～100 CFU的孢子悬液。以上各菌悬液或孢子悬液同时各取2份注入琼脂培养基培养，采用平皿计数法计数，结果见表1。

表1 微生物限度检查活菌计数结果

2.4细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2.4.1验证方法与结果 实验组：采用平皿法，取1:10供试液及50～100 CFU/ml实验菌各1 ml，加入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基20 ml，每株实验菌平行制备2个平皿，待凝固后，按规定温度培养48～72 h，按菌落计数方法测定其菌数，进行3次独立的平行实验，并分别计算实验组和稀释剂对照组的菌回收率。依据《中华人民共和国药典(一部)》2010版附录微生物限度检查方法[2]进行判定，结果见表2。

表2 细菌、真菌和酵母菌计数方法回收率结果(n=3，%)

菌液组：测定所加的实验菌数。

供试品对照组：取规定量1:10供试液，按菌落计数方法测定样品本底菌数。结果均未见菌生长。

稀释剂对照组：取稀释液1 ml，同实验组方法测定菌数。结果5种实验菌回收率均>70%。

2.4.2样品细菌、真菌或酵母菌计数检查 取3批样品各10 g，按“2.2”项下方法制成1:10的溶液。取1:10溶液10 ml，用pH 7.0无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液按10倍递增稀释法依次制成1:100，1:1 000，1:10 000的供试液。取3批样品的上述3种浓度供试液各1 ml分别加入平皿中，然后倾入20 ml冷至45℃的营养琼脂培养基(细菌计数)，另取1:10和1:100供试液各1 ml分别加入平皿中，倾入20 ml冷至45℃的玫瑰红钠琼脂培养基(真菌、酵母菌计数)，混匀，凝固后倒置于特定温度的培养箱中培养(营养琼脂培养基的培养温度为35℃，培养时间为3 d；玫瑰红钠琼脂培养基的培养温度为25℃，培养时间为5 d)。每个稀释级的供试液平行制备2份；另取稀释液1 ml作阴性对照。结果表明，3批样品按验证方法检查，细菌、真菌或酵母菌总数均<10 CFU/ml，符合规定。

2.5控制菌检查方法的验证

2.5.1菌种选择 按照《中华人民共和国药典(一部)》2010版附录微生物限度检查法[4]中的有关控制菌检查方法，水调散应检查金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。

2.5.2菌液和供试液的制备 菌液按“2.3”项下方法制备，菌数控制在10～100 CFU/ml。供试液按本文“2.2”项下方法制备。

2.5.3验证方法与结果 取100 ml营养肉汤培养基6份， 2份分别加入10 ml供试液(1:10)及1ml 10～100 CFU/ml金黄色葡萄球菌作为实验组，2份分别加入1 ml 10～100 CFU/ml金黄色葡萄球菌作为阳性对照组，2份分别加入稀释剂10 ml 作为阴性对照组，均在30～35℃培养24 h。取上述各增菌培养物，用接种环沾取1～2环培养液划线接种至甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，35℃培养24 h。另取100 ml胆盐乳糖培养基6份，其中：2份分别加入10 ml供试液(1:10)及1 ml 10～100 CFU/ml铜绿假单胞菌悬液作为实验组；2份分别加入1 ml 10～100 CFU/ml铜绿假单胞菌悬液作为阳

性对照组；2份分别加入稀释剂10 ml 作为阴性对照组。上述各组均在30～35℃培养24 h。取上述各增菌培养物，用接种环沾取1～2环培养液划线接种至溴化十六烷基三甲基铵琼脂培养基的平板上，35℃培养24 h。依据上述检查方法进行判定， 结果显示，实验组和阳性对照组控制菌生长良好，阴性对照组未检出。详见表3。

表3 检查控制菌的结果

2.5.4样品控制菌检查 取3批样品1:10的供试液各10 ml，分别接种至营养肉汤培养基100 ml中；另取金黄色葡萄球菌的10～100 CFU/ml菌悬液1 ml、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 ml分别接种至同样培养基中作为阳性对照和阴性对照。另取3批样品1:10的供试液各10 ml，分别接种至胆盐乳糖培养基100 ml中；取铜绿假单胞菌的10～100 CFU/ml菌悬液1 ml、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 ml分别接种至同样培养基中作为阳性对照和阴性对照。3批样品按验证方法检查,供试品组及阴性对照组均未见细菌生长，结果符合规定(表4)。

表4 样品控制菌检查结果

3 讨论

在对药品进行微生物限度检查方法验证时，采用预实验方法对验证用菌株抑菌活性的强弱进行预测，为正式实验提供依据，同时减少工作量及试药、试剂的浪费，提高工作效率。根据《中华人民共和国药典(一部)》微生物限度检查方法的规定,含抑菌成分的制剂, 必须消除供试液的抑菌活性, 然后再进行微生物限度检查。预实验结果表明，水调散有抑菌作用，且由于该制剂是由原药材细粉制成的散剂，制成供试液时存在大量的不溶性颗粒，采用常规法进行细菌、真菌和酵母菌计数检查及控制菌检查时，对结果判断有干扰。而采用离心沉淀法时，既能消除本品在检查条件下的抑菌作用，又可排除对菌落计数的干扰，使污染的微生物顺利检出。

微生物限度检查方法验证为活菌计数实验，其实验方法受菌悬液浓度、培养基、培养条件、实验操作等诸多因素影响[5]。每次验证实验应尽量平行，以保证实验的可重复性，且日常检验方法应与验证方法保持一致，以保证检验结果的准确性。

微生物的污染、生长和繁殖是影响中药制剂质量的重要因素，也是中药制剂生产过程中比较突出的问题。尤其是中药原粉入药的散剂，从药材清洗、干燥、粉碎到制剂成形工艺过程，每一环节都有可能染菌。因此，为了保证中药制剂质量，使制剂中不含或少含微生物，必须控制中药制剂生产整个环节中的微生物限度，严格执行符合《中华人民共和国药典(一部)》的相关规定。

【参考文献】

[1] 国家药典委员会．中华人民共和国药典一部[S] ．北京：化学工业出版社出版，2010：附录：88.

[2] 李晓东，李 娟，焦正花，等.我国医院中药制剂微生物限度检查存在的问题分析与建议[J].甘肃中医,2009，22(12)：15-17.

[3] 冒兴建，闫玉梅，秦 建.中药口服制剂维生素限度检查不合格的原因及解决办法[J].中国现代药物应用,2011,5(10)：130-131.

[4] 国家药典委员会．中华人民共和国药典一部[S] ．北京：化学工业出版社出版，2010：附录： 79-88.

[5] 杨 静.药品微生物限度检查法的影响因素分析[J].中国药事,2008,22(12)：1095-1096.