4种海星的α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

张改云, 范 林, 侯忠海，张玉便，杨艳柳 (.国家海洋局第三海洋研究所生物遗传资源重点实验室，福建 厦门 36005；.东华大学化学化工与生物工程学院，上海 060)

糖尿病是以持续高血糖为基本生化特征的一种常见的内分泌代谢性疾病。目前临床上常用的口服降血糖药物主要有硫脲类、双胍类、噻唑烷二酮类、非磺脲类ATP敏感性钾通道抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂等。临床上使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要为阿卡波糖和伏格列波糖。近年来，天然产物来源的抑制葡萄糖苷酶的研究已成为糖尿病治疗药物研究的热点之一[1]。海星是一种营养丰富、价值极高的海洋动物，不仅能食用和饲用，而且可以药用，具有一定的经济和药用价值及良好的开发利用前景。现代药理研究表明，海星具有抗癌、抗病毒、抗细菌、抗真菌、溶血、抗动脉粥样硬化、降压、抗炎等活性[2]。笔者采用小鼠口服糖耐量试验结合体外α-葡萄糖苷酶-抑制剂模型研究了4种海星对α-葡萄糖苷酶抑制作用及其活性部位。

1 材料

1.1仪器与试剂 对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG，Sigma公司)、阿卡波糖(acarbose，拜耳医药保健有限公司)、四氧嘧啶(USA，Sigma公司)、葡萄糖测定试剂盒(北京普利来生物制品有限公司)、血糖仪(EZ Smart型，台湾台欣公司)、血糖试纸(EZ Smart血糖测试片)。

1.2药物 海星样品：4种海星均购自厦门市第八海鲜市场，由国家海洋局第三海洋研究所生态室王建军博士分别鉴定为：罗氏海盘车(AsteriasrollestoniBell)、飞白枫海星(Archastertypicus)、骑士章海星(StellasterequestrisRetzius)和中华疣海星(Pentacerasterchinensis)。

1.3动物 清洁级ICR小鼠，18～22 g，雄性，购自斯莱克实验动物有限公司。动物合格证号：SCXK(沪)2012-0002。饲养条件：动物进入实验室后，小鼠每笼放养10只，饲养3 d后用于实验，由专人饲养管理。动物室光照充足，通风和空调设备良好，室温控制在20～25 ℃，相对湿度为60%～70%。实验室按常规定期消毒。

2 方法

2.1海星提取方法 将4种海星各100 g用剪刀剪碎，分别加入70%的乙醇200 ml，超声提取3次，每次30 min，合并滤液，减压浓缩蒸干即得海星的粗提物。

2.2α-葡萄糖苷酶标准曲线制作 用磷酸缓冲液配制1 000 mol/L pNPG，并稀释成100、70、45、15、10、5、1 mol/L。分别取上述7种不同浓度的pNPG溶液各100 ml，加入100 μl，500 U/L α-葡糖苷酶，置于37 ℃恒温水浴箱25 min；然后加入0.2 μmol/L NaOH溶液100 ml，混匀，在405 nm下测定消光度OD值，测3组，取平均值。以OD值为纵坐标，对硝基苯酚浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.3测定α-葡萄糖苷酶活力 在112 μl磷酸钾缓冲液(pH 6.8)中加入200 U/L α-葡萄糖苷酶20 μl、DMSO 8 μl，置于37 ℃恒温水浴箱15 min后加入2.5 mmol/L pNPG 20 μl，摇匀，37 ℃温育15 min，再加入0.2 mol/L Na2CO3溶液80 μl，于405 nm波长下测OD值。

2.4测定α-葡萄糖苷酶抑制率 葡萄糖苷酶10 μl，加入样品液20 μl(各药物的终浓度为1 mg/ml)，于37 ℃恒温水浴箱温育15 min；然后加入70 μl pNPG溶液，于37℃水浴反应25 min；再加入70 μl，0.15 mol/L的NaOH溶液终止反应，放入37 ℃恒温水浴箱显色15 min。在405 nm处测定吸光度(An)。以PBS溶液代替酶液作为阴性对照(A1)；以PBS溶液代替样品液作为空白对照(Ao)；1 mg/ml的阿卡波糖溶液代替样品液作为阳性对照。葡萄糖苷酶的抑制率(I)= [Ao- (An-A1)]/Ao×100%。

2.5高血糖小鼠口服糖耐量试验 取ICR小鼠60只，造模前禁食16 h，饮水不限。四氧嘧啶用蒸馏水新鲜配制成浓度为6 mg/ml的溶液，以60 mg/kg(0.2 ml/20 g，iv)造模。48 h后血糖仪测量血糖值，取血糖值不低于14.5 mmol/L者用于实验。模型动物60只随机分成6组，每组10只，即模型对照组、阿卡波糖组、4种海星粗提物组(相当于海星10 g/kg，iv)；另取10只正常小鼠为空白组。

所有小鼠禁食12 h，给予灌胃药物(受试药阳性阿卡波糖，对照生理盐水)30 min后，麦芽糖按2.5 g/kg体重的剂量灌胃，分别在0、45、90 min从尾静脉采血，检测血糖变化。

2.6正常小鼠口服糖耐量试验 取ICR小鼠60只，按体重随机分成6组，即空白组、阿卡波糖组，4种海星粗提物组(相当于海星10 g/kg，iv)，每组10只。所有小鼠禁食12 h，给予灌胃药物(受试药阳性阿卡波糖，对照生理盐水)30 min后，麦芽糖按2.5 g/kg体重的剂量灌胃，分别在0、45、90 min从尾静脉采血，检测血糖变化。

3 实验结果

3.1α-葡萄糖苷酶标准曲线 如图1所示，α-葡萄糖苷酶标准曲线为Y=0.005X+0.044，r=0.999 5，其线性良好。

图1 α-葡萄糖苷酶的标准曲线

3.2海星提取物对正常小鼠口服糖耐量的影响 正常小鼠给予麦芽糖后，各组小鼠血糖均升高，30 min后血糖持续恢复；与0 min比较，30、60 min时血糖升高具有统计学意义(P<0.01)。与0 min比较，阳性对照阿卡波糖组和罗氏海盘车粗提物组在30、60、120 min血糖升高不具有统计学意义(P>0.05)，表明其对正常小鼠口服麦芽糖后血糖升高有一定抑制作用。而飞白枫海星、骑士章海星和中华疣海星粗提物则无显著改善正常小鼠口服糖耐量作用(表1)。

表1 4种海星提取物对正常小鼠糖耐量的影响

1)P< 0.05，2)P< 0.01，与0 min比较

3.34种海星提取物对高血糖小鼠口服糖耐量的影响 正常小鼠和高血糖小鼠灌胃麦芽糖后各组小鼠血糖均升高，0.5 h小鼠血糖均达到最高值，然后逐渐降低。阳性对照阿卡波糖组和罗氏海盘车粗提物组对四氧嘧啶性高血糖小鼠的糖耐量有明显改善作用(表2)。

表2 海星提取物对高血糖小鼠糖耐量的影响

1)P< 0.05，2)P< 0.01，与模型组比较

3.4罗氏海盘车粗提物中不同活性部位对α-葡萄糖苷酶的作用 笔者进一步对罗氏海盘车的粗提物用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取，得到4个相应的萃取物，活性结果表明，其中正丁醇部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性最高，浓度为1 mg/ml时抑制率为89.6 %；其次为乙酸乙酯部分，抑制率为60.2%，而石油醚和氯仿部分则活性较弱(表3)。

表3 罗氏海盘车不同提取部位与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶影响的比较

4 讨论

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)又称葡萄糖苷水解酶、麦芽糖酶，位于小肠刷状缘膜上皮细胞,能将双糖如蔗糖、麦芽糖等水解成可被小肠吸收的单糖，是食物中糖(碳水化合物)水解的关键酶。因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用机制是抑制糖在小肠上部的吸收，减少葡萄糖吸收入血，进而抑制餐后高血糖，改善对血糖的控制，降低餐后血糖升高的幅度，可减轻对胰岛B细胞的刺激，从而使血浆胰岛素分泌减少，起到缓解胰岛B细胞负荷的作用[3]。1995年，阿卡波糖(拜糖平，acarbose)被FDA批准用于临床，在2型糖尿病的治疗中发挥重要作用，但有一定的副作用。因此，有必要继续研发副作用小、疗效可靠的α-葡萄糖苷酶抑制剂。海星含有大量结构独特的具有生物活性的代谢产物，如皂苷、生物碱、甾醇、多糖、维生素、蛋白质、多肽和氨基酸等，它们具有抗癌、抑菌、抗病毒、抗炎、降血压、降血糖和降血脂等活性[4]。许东晖等[5]研究发现从多棘海盘车中分离并经结构修饰获得的海星甾醇A1998可明显降低四氧嘧啶及链脲霉素诱导的小鼠糖尿病模型的血糖含量，其机制与增强胰岛细胞对葡萄糖反应的敏感性有关。笔者研究了4种海星的降血糖作用并发现抑制α-葡萄糖苷酶的活性部位。

四氧嘧啶是一种特异性细胞毒性物质，可选择性损伤动物胰岛B细胞，促进氧自由基释放，直接破坏B细胞膜结构，损伤DNA，使胰岛素合成障碍，空腹血糖升高。笔者采用四氧嘧啶造糖尿病小鼠模型，首先通过正常小鼠和糖尿病小鼠口服糖耐量试验[6,7]比较研究了4种海星的乙醇提取物改善口服糖耐量的作用，发现罗氏海盘车的乙醇提取物具有显著改善正常小鼠和糖尿病小鼠口服糖耐量的作用，提示罗氏海盘车的乙醇提取物可能通过增加胰岛素分泌，提高胰岛素敏感性或抑制α-葡萄糖苷酶起到降低餐后血糖的作用。由于罗氏海盘车的乙醇提取物不增加胰岛素分泌和胰岛素敏感性，而是具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，减少麦芽糖水解为单糖，进而抑制餐后高血糖。笔者进一步建立体外α-葡萄糖苷酶抑制剂模型[8,9]，确定罗氏海盘车粗提物中抑制α-葡萄糖苷酶的活性部位,发现正丁醇萃取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性最高，其次为乙酸乙酯部位。罗氏海盘车属海星纲(Asteroidea)钳棘目(Forcipulatida)海盘车科(Asteriidae)动物，资源丰富，在我国黄海有大量分布。在民间，罗氏海盘车常被用来预防或治疗胃溃疡、补肾壮阳等，具有较高的药用价值，文献报道了罗氏海盘车中含有微量元素、氨基酸、皂苷和腺苷等[10]。笔者发现其大极性的正丁醇部位和中等极性的乙酸乙酯部位具有较好的抑制α-葡萄糖苷酶活性，拓宽了其应用价值，但其具体的降糖活性成分尚有待进一步的研究。

【参考文献】

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[4] 黄宗国．中国海洋生物种类与分布[M]. 北京: 海洋出版社, 1990, 705-708.

[5] 许东晖, 许实波．海洋新化合物A1998降血糖作用机制研究[J]. 中草药，1999, 30 (10): 752-755.

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[10] 刘 涛, 詹永成, 裴月湖. 罗氏海盘车中一个新的脑苷脂类化合物罗氏脑苷[D]. 中国天然药物, 2007, 5 (3): 179-181.