应用高效液相色谱法测定葫芦素片中葫芦素B的含量

豆甲泰,李胜文 (解放军209医院药械科，黑龙江 牡丹江 157011)

葫芦素片临床上主要用于湿热毒盛所致迁延性肝炎、慢性肝炎及原发性肝癌的辅助治疗。其主要成分是从葫芦科植物甜瓜瓜蒂中提取出的葫芦素B，国内外学者对葫芦素B抗癌机制的研究可归纳为：葫芦素B分子结构侧链上带有的不饱和羰基，是高度亲电子中心的亲核基团，可使控制细胞分裂的酶烷化，从而抑制肿瘤细胞的生长。据研究其还具有细胞毒性、保肝、提高机体免疫力和抗炎活性等多种作用[1-3]。本实验采用反相高效液相色谱法，对葫芦素片中葫芦素B的含量进行测定，方法简便快捷，结果准确、可靠。

1 仪器和试药

Aglilent-1100高效液相色谱系统包括四元泵，柱温箱，自动进样器，紫外检测器，Aglilent-1100色谱工作站。实验用超纯水由Milli-Q超纯水器制备系统 (Millipore Corporation, MA,U.S.A.)提供。葫芦素片(批号:080301、080601、080901、090101、090102、090601、090602、090701、091001、091002，浙江普洛康裕天然药物有限公司)，葫芦素B标准品(自制,纯度>98.5%)。乙腈、甲醇(色谱纯，Merck公司)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm, )；流动相：乙腈-水=(51:49)；流速: 1.0 ml/min；进样体积：4 μl；柱温：25 ℃。葫芦素B标准品及供试品色谱图,见图1。

2.2对照品溶液的制备 精密称取葫芦素B标准品适量，加入无水甲醇适量制成1 mg/ml的标准溶液。将上述溶液通过微孔滤膜后，放入4 ℃冰箱中备用。

2.3供试品溶液的制备 取葫芦素片18片，精密称定，研细，取细粉约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇30 ml，超声振摇30 min，放置10 min，滤过，用少量甲醇洗涤，洗液并入同一量杯中，并用甲醇定容为30 ml，摇匀，即得。取续滤液过0.45 μm微孔滤膜，4℃保存，供进样分析用。

2.4线性关系考察 准确配制葫芦素B对照品的甲醇溶液，浓度为1 mg/ml，自动进样量分别设为0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μl测出葫芦素B的峰面积，同时以对照品含量为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程：Y=1 067.3C-0.508 4,r=1,n=7;结果表明葫芦素B在进样量为0.1～16 μg时具有良好的线性关系。

图1 葫芦素B高效液相色谱图

2.5精密度实验 取对照品溶液，连续进样6次，每次进样4 μl，再以上述色谱条件和检测方法下测定对照品的峰面积，RSD=0197%，说明本法精密度较好,结果见表1。

表1 葫芦素片精密度、稳定性、重复性实验结果(n=6)

2.6重复性实验 取葫芦素片粉末(批号：090602，浙江普洛康裕天然药物有限公司)，6份每份0.2 g，精密称定。按“2.3”项下制备，并在上述色谱条件和检测方法下测定，记录色谱峰的峰面积，计算出每0.2 g葫芦素片中葫芦素B的平均含量为0.190 3 mg，计算葫芦素B含量的RSD=3.87%,说明本法重复性较好。

2.7稳定性实验 取葫芦素片粉末(生产厂家：浙江普洛康裕天然药物有限公司；批号：090602)，按照“2.3”项下制备供试品溶液，分别在样品制备并于室温(25 ℃)放置0、2、6、10、16、24 h后在上述色谱条件和检测方法下测定，记录色谱峰的峰面积，计算峰面积RSD=1.27%,说明供试品溶液中各目标成分至少在24 h内稳定，满足样品测定的要求。

2.8加样回收率实验 精密称取葫芦素片粉末(批号：090602，浙江普洛康裕天然药物有限公司)，6份0.2 g，精密加入对照品适量，按照“2.3”项下制备供试品溶液，在上述色谱条件和检测方法下进行检测，记录色谱峰的峰面积，计算葫芦素B含量。回收率=(测得葫芦素B的含量-葫芦素片中葫芦素B的含量)/对照品加入量×100%。加样回收率和RSD值见表2。结果表明，葫芦素B的平均回收率为99.39% ，RSD为0.48 %，说明回收率较高。

表2 葫芦素片加样回收率试实结果(n=6)

2.9样品含量测定 取同一厂家(浙江普洛康裕天然药物有限公司)生产的6个不同批号的葫芦素片样品。按照“2.3”项下制备供试品溶液，在上述色谱条件和检测方法下进行检测，记录色谱峰的峰面积，计算各批次葫芦素片中葫芦素B的含量，每批测3次，取平均值(表3)。结果表明：6个批次中的葫芦素片中葫芦素B含量最低为0.076 7%，符合葫芦素B 0.06 mg/片的要求，所测6批样品均合格。

3 讨论

3.1流动相的选择 本实验试用不同配比的乙腈-水系统进行洗脱，最终发现以流动相乙腈∶水(51∶49)系统为佳，各色谱峰的分离度较好，保留时间适中。

3.2提取溶剂、方法及时间的优化 笔者采用超声波提取法，以甲醇为提取溶剂，先后采用甲醇8、12、20 ml；提取时间20、30、50 min；最终确定甲醇12 ml，提取30 min效果最佳。

表3 样品含量测定结果(n=6)

3.3检测波长的选择 对葫芦素B进行UV测试，发现在228 nm处有最大吸收，故选择228 nm作为含量测定的检测波长[4-10]。

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