小剂量阿司匹林对前列腺癌细胞的增殖抑制作用研究

关云哲，王振中

(长春市中心医院 泌尿外科，吉林 长春130051)

前列腺癌 (prostate cancer )是男性生殖系最常见的恶性肿瘤之一，发病随年龄的增长而增加，其发病率有明显的地区差异，占男性癌症死亡的第二位[1]。目前，前列腺癌的病因尚未明确，可能与遗传、环境、性激素等因素有关。98%的前列腺癌为腺癌，常从前列腺萎缩的外周部分发生，大多数为多病灶癌[2]。

阿司匹林(aspirin)与其同时代诞生的绝大多数药物相比，因其药理作用不断有新发现，适应证不断有新扩展[3]。近年来，阿司匹林的抗癌作用受到广泛关注，特别是对前列腺癌等的预防或抑制的研究已成热点，研究表明，长期服用阿司匹林可以明显降低多种癌症的发病率[4]。

本文初步研究经aspirin治疗，对前列腺癌细胞系PC-3的细胞增殖抑制作用及机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂

aspirin由长春市中心医院泌尿外科提供，用生理盐水稀释至1mM储存。DMEM细胞培养液，胎牛血清，噻唑蓝(MTT)。Bcl-2、COX-2、b-actin抗体及辣根过氧化酶(HRP)标记的抗鼠、抗兔二抗，均由sigma公司提供。

1.2细胞增殖抑制实验

将PC-3细胞浓度稀释约3×104个/ml，接种至96孔板中，每孔加样100 μl。培养24 h后，分别加入浓度为0、1、2、4、8、10 mM的aspirin，每组3个复孔，继续培养24 h后，换药，至48 h终止培养。每孔加入MTT (5 g/L) 20 μl， 4 h后离心弃上清。每孔加200 μl 的DMSO，避光震荡15 min，在酶标仪上测定570 nm的OD值，计算细胞生长抑制率及药物的IC50值。

1.3蛋白免疫印迹法

收集正常培养的细胞，以及经aspirin处理48 h的细胞，裂解液裂解细胞，经聚丙烯酰胺凝胶电泳。每孔加入样品20 μg，后转移至PVDF膜。用TBST，封闭1 h，加一抗(按说明稀释)4℃过夜。经TBST洗涤3次，每次10 min，后加二抗(辣根过氧化物酶标记，1∶5 000稀释)室温孵育1 h，TBST洗涤3次，显色。

1.4统计学方法

蛋白印记实验重复两次，MTT实验重复3次，两组均采用t检验，多组检验采用one-way ANOVA Tukey检验，P<0.05有显著的统计学意义。

2 结果

2.1不同浓度的aspirin对PC-3细胞的增殖抑制作用

将不同浓度的aspirin (0、1、2、4、8、10 mM)作用于96孔板中培养的PC-3细胞，48小时后通过MTT法检测细胞的增殖活力，发现随着aspirin浓度的增加对细胞的生殖抑制性更强。IC50值分别为3 mM±1.25 mM(表1)。

2.2检验1-5mM的aspirin处理后的PC-3细胞中，Bcl- 2、COX-2的蛋白表达水平

Bcl-2在给药前后均为阳性，但与未用药相比，经1 mM的aspirin处理的PC-3细胞表达无明显变化；但是3 mM、5 mM的aspirin处理的PC-3细胞表达略有下降，而两浓度之间下降表达无明显差异。COX-2给药前后也均为阳性，其表达水平明显下降，其中3mM、5mM的aspirin处理的PC-3细胞表达无明显变化。该实验重复2次，均取得类似结果，见图1。

表1 aspirin对PC-3细胞增殖影响

图1 不同浓度aspirin给药前后，Bcl-2和COX-2的蛋白表达状态

3 讨论

我们采用MTT法，研究aspirin对PC-3细胞增殖的作用。结果显示低浓度aspirin作用于前列腺癌细胞PC-3时，能够更好的抑制其细胞的增殖，且浓度越低、抑制作用越敏感。而高剂量的aspirin在实验中则趋势明显趋于平稳。根据文献显示：经aspirin处理的细胞增殖抑制作用，主要以细胞凋亡、延长细胞周期为主[5]。因此，本文以不同浓度的aspirin处理的PC-3细胞，对其观察Bcl-2、Cox-2的表达变化。

Bcl-2是一种膜蛋白，以细胞凋亡激活路径中的主要调控基因[5]。通过对肿瘤细胞凋亡的抑制，可延长肿瘤细胞存活时间，并对不同因素刺激诱导的凋亡有阻抑效应[6]。有研究显示，Bcl-2可参与aspirin诱导的细胞周期停滞[7]。实验显示，3 mM、5 mM浓度aspirin作用下的Bcl-2的表达略有下降变化，但这两个浓度之间的变化不大。

COX-2在肿瘤的进展中可涉及到多种相关机制，COX-2基因的过表达，可显著增加PGI2、PGE2

的蛋白合成，而PGE2对机体免疫功能有重要的负调控作用，特别是对T淋巴细胞亚群、NK细胞活性、LAK细胞活性、TIL、TNF、IL-2活性均有抑制作用，能够使肿瘤细胞逃避免疫监视[8]。因此，通过aspirin来抑制PC-3细胞系中COX-2基因的表达，从而抑制PC-3细胞系的生长。实验显示，经1 mM、3 mM、5 mM浓度的aspirin处理的PC-3细胞中的COX-2基因有明显降低趋势，但是3 mM、5 mM浓度的COX-2基因表达无明显差异。因此，可以看出，低浓度的aspirin能更有效的抑制前列腺癌细胞PC-3的生长，并通过凋亡通路促进细胞凋亡。

综上所述，aspirin通过分子生物学机制促进前列腺癌细胞凋亡，从而抑制细胞增殖。有报道显示，aspirin与其他药物如顺铂联合应用也能产生强大的协同抑制肿瘤效应[5]。因此，进一步探索aspirin诱导前列腺癌细胞凋亡的分子机制，以及与其他药物联合作用于前列腺癌细胞的作用机制，是前列腺癌治疗的研究方向之一。

参考文献：

[1]Pandeya N，Webb PM，Sadeghi S，et al．Gastro-oesophageal reflux symptoms and the risks of oesophageal cancer: are the effects modified by smoking，NSAIDs or acid suppressants[J].Gut，2010，59(1)：31.

[2]Rothwell PM，Fowkes GR，Belch JF， et al． Effect of daily aspirin on long-term risk of death due to cancer: analysis of individual patient data from randomised trials[J].Lancet，2011，377(9759): 31．

[3]Hyde CA，Missailidis S.Inhibition of arachidonic acid metabolism and its implication on cell proliferation and tumour-angiogenesis[J].Int，2009，9(6):701.

[4]Lee SK，Park MS，Nam MJ.Aspirin has antitumor effects via expression of calpain gene in cervical cancer cells [J].J Oncol， 2008:285374.

[5]Chan AT，Ogino S，Fuchs CS.Aspirin and the risk of colorectal cancer in relation to the expression of COX-2[J].N Engl J Med， 2007，356(2): 2131.

[6]Folkman J.Angiogenesis[J].Annu Rev Med，2006，57(1):1

[7] Chattopadhyay M，Goswami S，Rodes DB，et al． NO-releasing NSAIDs suppress NF-κB signaling in vitro and in vivo through Snitrosylation[J]．Cancer Letters，2010，298(2): 204.

[8]Dikshit P，Chatterjee M，Goswami A，et al.Aspirin induces apoptosis through the inhibition of proteasome function[J].J Biol Chem，2006，281(39): 29228.