不同浓度人参皂苷Rb1对成骨细胞增殖和分化的影响

王伟，黄坤，郑雷蕾

（1.银川市第一人民医院骨二科，宁夏银川750002；2.江苏省南通市海门人民医院骨科，江苏南通226000；3.重庆医科大学临床医学系，重庆400046）

不同浓度人参皂苷Rb1对成骨细胞增殖和分化的影响

王伟1，黄坤2，郑雷蕾3

（1.银川市第一人民医院骨二科，宁夏银川750002；2.江苏省南通市海门人民医院骨科，江苏南通226000；3.重庆医科大学临床医学系，重庆400046）

目的观察人参皂苷Rb1对成骨细胞增殖、分化的影响。方法选取出生24 h之内的SD乳鼠10只，提取分离成骨细胞，并经细胞形态观察、碱性磷酸酶活性化学染色法以及Giemsa染色法鉴定。根据加入不同浓度的人参皂苷Rb1将成骨细胞分为0、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L 5组；采用CCK-8法检测加药24、48、72 h后对成骨细胞增殖的影响；采用PNPP法检测成骨细胞中ALP活性，分析不同浓度的人参皂苷Rb1对成骨细胞分化的影响；Real-Time PCR法检测增殖标记基因PCNA、Ki67和分化标记基因COL1、BGP的表达水平。结果成功分离获得成骨细胞，经细胞形态学鉴定和染色结果显示细胞满足后续实验要求。CCK-8法检测结果显示：与0mol／L组相比，人参皂苷Rb1不同浓度组对成骨细胞均有不同程度的促进增殖作用（P＜0.05，P＜0.001）；碱性磷酸酶（ALP）比活性检测结果显示：与0mol／L组相比，人参皂苷Rb1 10－7、10－6、10－5mol／L浓度组分别培养3、5、7 d后，及10－8mol／L培养7 d后，成骨细胞活性均有显著升高（P＜0.05，P＜0.001），最佳效果浓度组为10－6mol／L；Real-Time PCR法检测结果显示：与0mol／L组相比，人参皂苷Rb1 10－7、10－6、10－5mol／L各浓度组均能显著提高成骨细胞PCNA、Ki67、BGP、COL1 mRNA表达水平，10－8mol／L可显著提高COL1mRNA表达水平，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.001），其中以10－6mol／L浓度组效果最佳。结论不同浓度（10－8、10－7、10－6、10－5mol／L）人参皂苷Rb1对成骨细胞增殖、分化具有明显促进作用。

人参；人参皂苷Rb1；成骨细胞；增殖；分化

骨质疏松症是随着现代影像医学的发展应用而得以认识的一种新疾病，它以骨量减少伴骨组织结构退化为特征，从而导致骨的脆性增高，增加骨折的危险性。骨质疏松症是一种全身代谢性骨骼疾病。中医认为骨质疏松症的病因病机涉及多个脏腑，主要以肾虚为本、脾虚为本以及肾脾俱虚为本占主导［1］。人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根。具有大补元气、补脾益肺、生津止渴、安神益智之效。人参的有效成分较多，其中人参皂苷Rb1为活性较强的人参二醇类。前期有研究表明人参水煎液或人参皂苷Rb1对骨质疏松症的治疗具有一定的疗效［2-3］。但关于人参治疗骨质疏松的有效部分，以及其作用机制仍不明了，使临床上应用人参治疗骨质疏松症缺乏实验研究基础，因此本研究旨在观察人参皂苷Rb1对体外培养的大鼠成骨细胞增殖分化的影响，从而探讨人参治疗骨质疏松的有效成分，为人参皂苷Rb1作用于骨质疏松的实验研究以及临床研究提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 出生24 h之内的SD乳鼠10只，SPF级，雌雄各半，购自武汉疾病预防控制中心，合格证号：SCXK（鄂）2005-0005。

1.1.2 主要试剂 人参皂苷Rb1（中国药品生物制品检定所），DMEM培养基、琼脂糖、0.1%Ⅱ胶原酶、0.25%胰蛋白酶（Gbico公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），CCK-8细胞增殖检测试剂盒（日本同仁化学研究所），碱性磷酸酶检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），Real-Time PCR试剂盒（Thermo Scientific）。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱（Heal Forse，HF240），低温高速离心机（Sigma公司，RS-28），倒置显微镜（Olypus XDS-1B型），酶标仪（Multiskan GO），实时定量PCR仪（Bio-Rad CF× 96），核酸蛋白分析仪（BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 成骨细胞分离、培养、纯化、传代［4］取出生24 h内新生SD乳鼠10只，不分雌雄，不计体质量。在无菌条件下剥取乳鼠的颅盖骨，立即置于预冷的PBS液中，剔除结缔组织。用PBS液清洗3次，将其置于盛有DMEM培养基的培养皿中，用无菌小剪剪成小碎块大小，0.5 mm×0.5 mm左右，加入5 mL 0.25%的胰蛋白酶，立即置于孵育箱中消化20min。加适量血清终止消化，弃去上清液，加入10mL的0.1%Ⅱ胶原酶，于孵育箱中消化90min。1000 r／min低温离心10min，弃上清，PBS洗涤沉淀3次，200目滤网过滤除去骨碎片，用DMEM混合培养液（含10%的胎牛血清、100 mg／L链霉素、100 U／mL青霉素）重悬细胞，吹打均匀后接种于培养瓶中。于37℃，5%CO2条件下培养。48 h后换液1次，以后隔天换液1次。至细胞融合成单层，密度为80%时，以1∶3的比例进行传代培养。取第2代以后的细胞用于实验。

1.2.2 成骨细胞鉴定 ①细胞形态观察：用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化以及生长状况并拍照。②碱性磷酸酶活性检测试剂盒检测细胞化学染色：取生长状态良好的第2代成骨细胞，按体积分数95%的乙醇固定30min后，严格按照碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。③Giemsa染色：取生长状态良好的第2代成骨细胞，甲醇固定10min，Giemsa染色2min，蒸馏水冲洗，倒置相差显微镜下观察并拍照。

1.2.3 成骨细胞增殖检测 取生长状态良好的成骨细胞按3.5×104个／mL接种于96孔培养板中，24 h后用培养基进行同步消化24 h，分别加入浓度为0、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L的人参皂苷Rb1培养液，每组设3个复孔。分别于加药24、48、72 h后，每孔加入CCK-8检测液10μL，在37℃、5%CO2培养箱中孵育3 h，于450nm波长处，酶标仪检测各孔光密度值（OD值）。

1.2.4 碱性磷酸酶（ALP）比活性检测 取生长状态良好的成骨细胞按5.0×104个／mL接种于24孔培养板，24 h换液1次，分别按浓度为0、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L、加入人参皂苷Rb1培养液，每组设3个复孔。分别于培养3、5、7 d后，严格按照碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒说明书检测ALP活性。

1.2.5 Real-Time PCR法检测PCNA、Ki67、COL1、BGP mRNA表达水平 取生长状态良好的成骨细胞按1.0×105个／mL接种于6孔培养板，常规培养24 h后，分别按浓度为0、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L加入人参皂苷Rb1培养液，每组设3个复孔。严格按照Real-Time PCR试剂盒说明书操作，提取总RNA，反转录为cDNA后，实时定量PCR仪扩增检测。所有引物均由上海生工生物工程公司设计合成。Real-Time PCR引物序列分别为：PCNA：上游：5′-TGGAATCCCAGAACAGGAG-3′，下游：5′-CCAATGTGGCTAAGGTCTCG-3′；Ki67：上游：5′-AAGGAACCATCAAGGCGAG-3′，下游：5′-ATCTGAGGCAGGGCTATCTG-3′；上游：5′-TGACTGGAAGAGCGGAGAGT-3′，下游：5′-AGTAGACCTTGATGGCGTCC-3′；上游：5′-GGACCATCTTTCTGCTCACTC-3′，下游：5′-CCAATGTGGCTAAGGTCTCG-3′；实验结果采用2－△△CT法计算出实验组与对照组的表达差异。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行数据统计分析。采用t检验数据进行分析，正态计量数据用“±s”表示。

2 结果

2.1 成骨细胞鉴定 倒置相差显微镜下可见成骨细胞形态饱满，多呈梭形和或多角形，细胞伸展，有长短不一的突起，偶可见突起相互连接呈网状或铺路石样排列紧密，细胞核清晰可见（见图1A）；碱性磷酸酶活性化学染色结果可见大量阳性细胞，其细胞膜及胞浆内颗粒呈蓝黑色颗粒（见图1B）；Giemsa染色结果可见呈三角形或梭形的成骨细胞胞浆丰富、呈蓝紫色，细胞核被染成深蓝色，核仁明显，位于细胞中（见图1C）。

图1 成骨细胞鉴定Fig.1 Identification of osteoblasts

2.2 成骨细胞增殖检测 由表1可见，加入人参皂苷Rb1培养液24、48、72 h后，CCK-8试剂盒检测结果显示，各浓度组对成骨细胞的增殖均有明显地促进作用，并呈一定时间浓度依赖性，最佳效果浓度组为10－6mol／L。

表1 人参皂苷Rb1对成骨细胞的增殖的影响（n＝9）Tab.1 Effect of ginsenosides Rb1 on osteoblast proliferation（n＝9）

2.3 成骨细胞分化检测 由表2检测结果可知，除10－8mol／L组3、5 d外，其他各组加入人参皂苷Rb1培养液后，分别培养3、5、7 d，碱性磷酸酶（ALP）检测成骨细胞活性均显著增加（P＜0.05，P＜0.001），并呈一定时间浓度依赖性，最佳效果浓度组为10－6mol／L。

表2 人参皂苷Rb1对成骨细胞的分化的影响（n＝9）Tab.2 Ginsenosides Rb1 effects on osteoblast differentiation（n＝9）

2.4 Real-Time PCR法检测PCNA、Ki67、COL1、BGPmRNA表达水平 由表3可见，与0 mol／L组相比，各浓度人参皂苷Rb1对成骨细胞PCNA、Ki67、COL1、BGPmRNA表达水平均有不同程度的增加，除10－8mol／L组的PCNA、Ki67、BGPmRNA，其他各组均有统计学差异（P＜0.05，P＜0.001），其中浓度组为10－6mol／L效果最佳。

表3 人参皂苷Rb1对成骨细胞PCNA、Ki67、COL1、BGPmRNA表达水平的影响（n＝9）Tab.3 Effect of ginsenosides Rb1 on osteoblast PCNA，Ki67，COL1，BGPmRNA expression levels（n＝9）

3 讨论

成骨细胞是来源于中胚层内外骨间或骨髓基质间的充质干细胞，它具有多向分化潜能，其分化是骨形成的关键，能够分泌细胞外基质蛋白，并负责骨基质的合成、分泌和矿化，在体内复杂的调解作用下分化形成骨祖细胞进而形成前成骨细胞［5-7］。因此防治骨质疏松症的关键之一就是促进成骨细胞的成骨功能。中医认为骨质疏松症的基本病因是多因素导致的肾虚、骨枯髓减，其主要原因可能为肾虚又可能为脾虚、肝病、血瘀等。人参具有补五脏，增强机体免疫力，对肝病也有一定的治疗作用［8-9］，其中人参皂苷Rb1为其主要有效成分。本文研究发现不同浓度人参皂苷Rb1（10－8、10－7、10－6、10－5mol／L）对成骨细胞增殖、分化具有不同程度的促进作用，这可能跟人参补五脏，治疗脾虚等症有关。

PCNA是Miyachi等于1978年发现鉴别的，它是一种细胞周期调解蛋白，其活性直接反应细胞增值活性，是理想的细胞增殖标记物［10-12］。而Ki67则是一种细胞核抗原，仅仅在增殖细胞核中表达，它可快速识别正在增殖分裂的成骨细胞［13-14］。在成骨细胞分化过程中，ALP是一种较为肯定的早期指标，随着细胞的分化其表达和分泌会随之增强，ALP活性越强表明成骨细胞骨形成的状况越好［15］。COLI是成骨细胞向基质成熟方向分化的标志，是钙盐沉着以及细胞附着的支架，它的合成分泌是骨组织形成的先决条件［16］。BGP在抑制成骨细胞生长软骨矿化的速度时起着重要的调节作用，它是有成骨细胞特异合成和分泌的一种非胶原蛋白，只会在矿化期才会被诱导表达［17］。治疗骨质疏松症的药物多具有促进成骨细胞增殖分化的作用。本研究观察Real-Time PCR法检测增殖标记基因PCNA以及Ki67的mRNA以及分化标记基因COL1、BGPmRNA的表达水平，结果显示与0mol／L组相比，10－7、10－6、10－5mol／L各浓度组均能显著提高成骨细胞PCNA、Ki67、BGP、COL1 mRNA表达水平，10－8mol／L可显著提高COL1 mRNA表达水平，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.001），其中浓度组以10－6mol／L效果最佳。这一结果提示人参皂苷Rb1对成骨细胞增殖、分化的作用，可能是通过上调增殖标记基因PCNA、Ki67以及COL1、BGP分化标记基因的mRNA表达水平有关。这与王俊俊等的研究结果相似［3］。

综上所述，人参皂苷Rb1对成骨细胞增殖、分化均具有不同程度的影响，为人参皂苷Rb1作用于骨质疏松的实验研究以及临床研究提供了科学依据，但其作用机制仍需进一步研究，本研究只观察了人参皂苷Rb1对成骨细胞增殖、分化的影响，并未观察对破骨细胞的影响，因此后期研究则可从这2方面加以研究。

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（编校：吴茜）

Effect of different concentrations of ginseng saponin Rb1 on osteoblast proliferation and differentiation

WANGWei1，HUANG Kun2，ZHENG Lei-lei3

（1.Department of Orthopedics，First People's Hospital of Yinchuan City，Yinchuan 750002，China；2.Department of Orthopaedics，Jiangsu Province People's Hospital of Nantong Haimen，Nantong 226000，China；3.Department of Clinical Medicine，Chongqing Medical University，Chongqing 400046，China）

ObjectiveTo observe the effects of ginseng saponin Rb1 on osteoblast proliferation and differentiation.Methods10 SD rats born within 24 h were separated and extracted for osteoblasts，the cellmorphologicalwere observed，and identified by alkaline phosphatase activity chemical dyeingmethod and Giemsa stainingmethod.Osteoblastswere divided into 0，10－8，10－7，10－6，10－5mol／L groups according to different concentration of ginsenosides Rb1，and CCK 8 method was used to detect osteoblast proliferation after incubation at24，48，72 h；PNPPmethod was used to detect the osteoblast ALP activity；Real-Time PCR method was used to detect the proliferation marker gene mRNA expression of PCNA and Ki67 and differentiation marker gene expression of COL1 and BGP.ResultsOsteoblastwere obtained and indentified，the qualitymet the subsequentexperimental requirements.CCK 8 test results showed that：compared with 0mol／L group，ginsenosides Rb1 groups of different concentrations promoted osteoblast proliferation in some degree（P＜0.05，P＜0.001）.Alkaline phosphatase（ALP）activity test results showed that：compared with 0 mol／L group，osteoblasts ALP activity of 10－7，10－6，10－5mol／L ginsenosides Rb1 groups at3，5，7 h and 10－8mol／L at7 d were significantly increased（P＜0.05，P＜0.001），and the best effect of concentration of 10－6mol／L.Real-Time PCR results showed that compared with 0 mol／L group，10－7，10－6，10－5mol／L ginsenosides Rb1 group significantly increased the concentration of osteoblasts PCNA，Ki67，BGP，COL1 mRNA expression，10－8mol／L significantly increased COL1mRNA expression（P＜0.05，P＜0.001），ofwhich the effectof10－6mol／Lwas best.Conclusion Different concentrations（10－8，10－7，10－6，10－5mol／L）of ginseng saponin Rb1 can accelerate osteoblast proliferation and differentiation.

ginseng；ginsenosides Rb1；osteoblasts；proliferation；differentiation

王伟，男，本科，主治医师，研究方向：骨与关节损伤与修复、矫形，E-mail：ww13895176182163.com。

R453.9

A

1005－1678（2014）08－0050－04

2009年博士点基金（20095503120006）