NEDD4-l对前列腺癌PC3细胞TrkA泛素化的影响

汪治宇，李幸，郭晓金，邢联萍，刘雅，单保恩Δ

（1.河北医科大学第四医院肿瘤免疫科，河北石家庄050011；2.美国罗切斯特大学病理科，美国罗切斯特14624）

NEDD4-l对前列腺癌PC3细胞TrkA泛素化的影响

汪治宇1，李幸1，郭晓金1，邢联萍2，刘雅1，单保恩1Δ

（1.河北医科大学第四医院肿瘤免疫科，河北石家庄050011；2.美国罗切斯特大学病理科，美国罗切斯特14624）

目的检测前列腺癌PC3细胞中泛素连接酶NEDD4-l（neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-1，NEDD4-1）对酪氨酸蛋白激酶A（tyrosine kinase A，TrkA）泛素化作用的研究，探讨NEDD4-l调节前列腺癌PC3细胞侵袭及迁移的机制。方法采用脂质体瞬时转染法将NEDD4-l质粒转染入前列腺癌PC3细胞中，应用蛋白免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）结合免疫印迹（immunoblotting，IB）法，观察外源的NEDD4-l和TrkA的相互作用；共表达NEDD4-l和ubiquitin，用Co-IP结合IB法检测NEDD4-1对TrkA的泛素化作用；共表达NEDD4-l和ubiquitin的同时，用蛋白酶体抑制剂MG132处理，观察TrkA水平的改变。结果转染NEDD4-1质粒后，外源性表达的NEDD4-l可与TrkA共沉淀；共表达NEDD4-1和ubiquitin后，NEDD4-1对内源的TrkA有泛素化作用，TrkA能与泛素共沉淀；共表达NEDD4-1和ubiquitin，用蛋白酶体抑制剂MGl32处理后，TrkA的泛素化降解被抑制。结论在前列腺癌PC3细胞中，TrkA是NEDD4-1的底物之一；NEDD4-1可调节TrkA的泛素化作用，促进其在蛋白酶体降解。

前列腺癌；NEDD4-1；TrkA；泛素化

前列腺癌是目前全球男性致死率排名第2位的肿瘤［1］，随着直肠指检、PSA分析、超声医学等技术的应用，其筛出率逐年增高。因此，阐明其发病机制，寻找新的治疗手段成为现代神经外科的研究热点之一。

近年来，蛋白泛素化降解在肿瘤发生机制中的作用越来越受到人们的重视［2］。蛋白的泛素化（ubiquitination）降解是指在泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）及泛素连接酶（E3）的依次作用下将多个泛素（ubiquitin）共价结合到特定的靶蛋白上，并被带到26S蛋白酶体降解的过程［3］。在多泛素化过程中，底物特异性由E3决定，因此E3是蛋白质泛素化过程重要的调节靶点，也是研究热点，其中，泛素连接酶NEDD4-l（neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-1，NEDD4-1）是近年来的研究热点之一［3-4］。NEDD4-1最早是由Kumarts等［5］发现的HECT（homologous to E6-APC-terminus）泛素连接酶，NEDD4-l包括一个N端的C2（Ca2＋／lipid-binding）结构域，中间的4个WW结构域及一个C端的HECT结构域，C2参与膜靶向结合，WW参与蛋白质的相互作用以及底物识别，HECT具有E3的催化活性，负责靶蛋白的泛素化和降解［4，6］。研究显示NEDD4-1可以与多种底物相互作用，现已鉴定的底物有：①离子通道和膜载体；②膜受体；③肿瘤抑制基因；④胞吞的蛋白［7-8］。因此，NEDD4与下列多种生物效应有关：神经信号的传导［9］，肿瘤发生与细胞生长［10］，细胞代谢［11］，受体的胞吞与降解，病毒的出芽［12］。NEDD4-1优先泛素化肿瘤抑制基因和胞吞的蛋白［13］。于如同等［14-15］研究发现，用NEDD4-1的小干扰RNA（siRNA）转染PTEN缺失的U251和U87胶质母细胞瘤细胞后，细胞的凋亡率明显升高，侵袭性降低；而过表达NEDD4-1则促进细胞的增殖和侵袭。

酪氨酸蛋白激酶A（tyrosine kinase A，TrkA）是神经生长因子（nerve growth factor，NGF）的高亲和力功能性受体，NGF的神经营养与保护作用必须与TrkA受体相结合才能得以实现［16-17］。而正常成年大鼠脑组织内仅有少数神经元表达TrkA。出血性脑损伤后，如何提高TrkA受体表达，对维持损伤神经元的结构，促进神经细胞损伤后的存活及修复，重建神经生理功能具有重要意义。TrkA是相对分子质量为140 kD的酪氨酸PK受体，其分子组成可以分为3个部分，即辨别并结合NGF的膜外部、跨膜部和由酪氨酸激酶产生酶活性的胞内区。胞外区含有 2个LRRs，具有识别并结合NGF的功能，胞内区有酪氨酸激酶以及结合src癌基因同源2（src homology domain，SH2）、PLC-yl的位点［18］，激酶部分是TrkA的催化部位，酪氨酸残基是TrkA关键的功能部位。相关研究结果分析Slitrk家族具有与TrkA类似的胞内区，其胞内区酪氨酸残基也是潜在的磷酸化位点，并且Slitrk调节神经元生长的作用机制与TrkA相似［19］。

已有文献报道在PC12细胞中，NEDD4可以将TrkA泛素化［20］。目前在前列腺癌中关于NEDD4-1和TrkA间作用的研究未见有报道，本实验拟采用体外前列腺癌PC3细胞为研究对象，通过免疫印记、免疫共沉淀等技术检测NEDD4-1与TrkA蛋白间的相互作用机制；并用蛋白酶体抑制剂处理，观察处理前后对TrkA蛋白水平的影响，进而为前列腺癌细胞侵袭、迁移的基因基础寻找到新的信号通路。

1 材料与方法

1.1 材料 pcDNA3.1-NEDD4-1质粒由美国Memorial Sloan-Kettering肿瘤中心细胞生物学实验室Xuejun Jiang教授馈赠。HA-ubiquitin质粒由中国社会科学院上海神经科学研究所馈赠。前列腺癌PC3细胞系，购自中国科学院上海细胞库。DH5a大肠杆菌购自北京天根生化科技有限公司。牛血清白蛋白（Amresco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），DMEM／F12（Gibco公司），MGl32蛋白酶体抑制剂（MERCK-Calbiochem公司），Ampicillin（上海生物工程有限公司），lipofectamine 2000（Invitrogen公司）。细胞培养板、培养皿（Coming公司），质粒抽提试剂盒（Invitrogen公司），PVDF膜（Milipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与脂质体转染 人前列腺癌细胞株PC3培养在10%胎牛血清的DMEM／F12培养基（含100 U／m L青霉素）中，于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养，细胞呈贴壁生长。待细胞长满后，弃掉培养液，0.25%胰蛋白酶消化，每隔2～3 d分瓶传代培养。

取对数生长期细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔细胞1× 106个，加入DMEM／F12完全培养基2mL继续培养。细胞达到约80%的融合度时更换新鲜培养液，2 h时后用脂质体（lipofectamine 2000）进行转染：将10μL lipofectamine 2000加入250μL opti-MEM中，混匀；将4μg pcDNA3.1-NEDD4-1质粒加入250μL opti-MEM中，混匀；然后将稀释好的lipofectamine 2000和质粒轻柔混匀，室温孵育20min；把孵育好的混合物均匀加入细胞培养板中继续培养，48 h后收集细胞进行检测。

1.2.2 蛋白免疫印迹法 收集转染48 h的PC3细胞，每个10 cm培养皿加1mL的NP40裂解缓冲液冰上裂解30min。进行离心（4℃，12000 r／min，30min）。收集上清液蛋白，－80℃保存备用。50μg蛋白行SDS-PAGE电泳，以湿转法将蛋白质转移至PVDF膜上，5%脱脂奶室温封闭1 h，TBST洗膜（5min×5）；一抗4℃孵育过夜，TBST再次洗膜（5min×5）加入相应HRP标记的二抗，室温2 h，TBST洗膜（5min×5）；ECL发光。以等量蛋白质上样β-actin对照，分析条带的灰度值与各自的内参β-actin的比值来判断目的蛋白的表达水平。

1.2.3 免疫共沉淀结合免疫印迹技术检测NEED4-1与TrkA相互作用 将上述－80℃保存的上清液蛋白，用分光光度计进行比色分析测定蛋白浓度。留取2个500μg蛋白行免疫共沉淀。将每组蛋白样品加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液至1 mL，分别加入2μg相应的单克隆抗体（沉淀NEDD4-1用NEDD4-1抗体，阴性对照组加入抗体兔IgG），4℃转轱24 h；再加入30μL Protein G Agarose，4℃转轱24 h，用NP40裂解液洗Protein G Agarose 5次，最后加入30μL 2×SDS上样缓冲液悬起混匀；煮沸10min，使蛋白充分变性，离心（4℃，2000 g，15min），将上清行免疫印记检测。如1.2.2所示步骤进行免疫印迹，分为3组（见表1）：Input组上样量为50μg，其余2组将免疫共沉淀产物上清全部加入上样孔。

表1 免疫印迹实验分组Tab.1 Grouping of IB

1.2.4 检测NEDD4-l对内源的TrkA的泛素化 共表达NEDD4-1和ubiquitin用蛋白免疫共沉淀（Co-IP）结合免疫印迹（IB）法，检测NEDD4-l对内源的TrkA的泛素化作用。如前面所示步骤，单独或者同时转染pcDNA3.1-NEDD4-l质粒和HA-ubiquitin质粒至PC3细胞中，然后进行蛋白免疫共沉淀和免疫印迹。免疫印迹分为3组（见表2）。

表2 免疫印迹实验分组Tab.2 Grouping of IB

1.2.5 免疫印迹（IB）观察TrkA水平的改变 共表达NEDD4-1和ubiquitin，用蛋白酶体抑制剂MGl32处理，用免疫印迹（IB）观察TrkA水平的改变，反映其降解情况。每孔质粒DNA lμg，脂质体2.5μL。转染后5 h换液，转染32 h取出一组4孔加入10μM蛋白酶抑制剂MGl32，每孔加入20 mg／mL的 MGl32 0.118μL，其终浓度为10μM。处理16 h，然后用NP40细胞裂解液（已加蛋白酶抑制剂）裂解细胞。如上述步骤所示，进行免疫印迹分组（见表3）。

表3 免疫印迹实验分组Tab.3 Grouping of IB

2 结果

2.1 前列腺癌PC3细胞过表达NEDD4-1后，外源性NEDD4-可以和内源性TrkA共沉淀 采用脂质体转染法将pcDNA 3.1-NEDD4-1质粒转染入PC3细胞后48 h，应用免疫共沉淀结合免疫印迹技术检测发现：NEED4-1可与内源性TrkA共沉淀，IgG抗体对照组则无共沉淀现象（见图1）。

图1 外源性NEDD4-1与内源性TrkA可以共沉淀Fig.1 Endogenous TrkA co-precipitated with exogenous NEDD4-1

2.2 共表达NEDD4-1和ubiquitin，NEDD4-1对内源的TrkA有泛素化作用，TrkA能与泛素共沉淀 将pcDNA3.1-NEDD4-1质粒和HA-ubiquitin质粒共转染入PC3细胞，转染后48 h，应用免疫共沉淀结合免疫印迹技术检测发现（见图2）：HA-ubiquitin与内源性TrkA可以共沉淀，IgG抗体对照组没有共沉淀现象，提示NEDD4-1对内源的TrkA有泛素化作用。共表达NEDD4-1和ubiquitin，NEDD4-1对内源的TrkA有泛素化作用，TrkA能与泛素共沉淀。用HA-ubiquitin质粒和／或不和pcDNA3.1-NEDD4-1质粒转染PC3细胞，应用免疫共沉淀结合免疫印迹技术检测ubiquitin与内源性TrkA可以共沉淀（lane 1，2，5，6），IgG抗体对照组没有共沉淀现象（lane 3，4），NEDD4-1对内源的TrkA有泛素化作用（lane 6）：泛素化的TrkA可以用HA抗体检测（1anes 1，2，5，6）；过表达外源性泛素可以用HA抗体检测（lane 1～6）。

图2 外源性泛素可以与内源性TrkA共沉淀Fig.2 Exogenous ubiquitin co-precipitated with endogenous TrkA

2.3 共表达NEDD4-1和ubiquitin后，用蛋白酶体抑制剂MGl32处理，TrkA的泛素化降解作用能够被抑制 将 pcDNA3.1-NEDD4-1和HA-ubiquitin质粒共转染入U251细胞，转染32 h后，再用蛋白酶体抑制剂MGl32处理16 h，免疫印迹结果发现：与对照组比较，共表达NEDD4-l和ubiquitin（共转染组），TrkA蛋白的表达量显著降低（P＜0.01）；MGl32处理后，这一差异消失，说明共转染组对TrkA泛素化降解作用能够被抑制（见图3）。

图3 外源性NEDD4-1介导TrkA泛素化降解**P＜0.01，与对照相比Fig.3 Exogenous NEDD4-1 regulates ubiquitination of TrkA **P＜0.01，compared with control group

3 讨论

常规检测目的蛋白相互作用的方法是免疫共沉淀技术，该技术是一种微量、灵敏和特异性强的检测方法，广泛应用于肿瘤、酶与病毒、寄生虫、信号转导等蛋白质相互作用的研究中，已经成为研究蛋白质相互作用的一个可靠技术［21］。

本研究应用免疫共沉淀结合免疫印迹技术可以检测到内源性TrkA可以被结合了NEDD4-1抗体的琼脂糖珠子（protein G-Agarose beads）沉淀下来，而对照抗体兔IgG却不能出现共沉淀。说明NEDD4-1和TrkA 2种蛋白质是存在相互作用的。

为了进一步证实NEDD4-1是否介导了TrkA的泛素化作用。用HA-ubiquitin质粒与pcDNA3.1-NEDD4-1质粒一起或单独转染PC3细胞，观察TrkA的泛素化现象。用免疫共沉淀结合免疫印迹技术，检测到TrkA可以与结合了HA抗体的琼脂糖珠子共同沉淀下来，而对照抗体却没有沉淀现象出现。NEDD4-1蛋白也可以一起被沉淀下来，但是因为本实验所用的pcDNA3.1质粒载体上也带有HA-tag，所以虽然被沉淀下来，但不能肯定的说是3者共沉淀的，当然也存在3者共沉淀的可能性，而且理论上也应该是3者共沉淀。

泛素化过程的最终是要进入泛素-蛋白酶体通路进行降解［22］。为了探讨应用蛋白酶体抑制剂是否能阻止TrkA泛素化降解。采用HA-ubiquitin质粒与pcDNA3.1-NEDD4-1质粒一起或单独转染PC3细胞，并设立空白对照组，转染32 h后，参考相关文献方法［23］，取出一组用10μM蛋白酶体MGl32处理16 h，免疫印记技术检测发现共转染组TrkA被泛素化降解，而用10μM蛋白酶体MGl32处理16 h组泛素化降解被抑制。本文结果表明NEDD4-1能介导TrkA的泛素化，并将其带到蛋白酶体处进行降解。但泛素化作用如何参与并调节PC3细胞的迁移和侵袭，是下一步的主要研究方向。

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（编校：吴茜，刘路路）

Regulation effect of NEDD4-1 on ubiquitination of the TrkA in prostate cancer cells

WANG Zhi-yu1，LIXing1，GUO Xiao-jin1，XING Lian-ping2，LIU Ya1，SHAN Bao-en1Δ

（1.Department of Tumor Immunology，The Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Pathology，University of Rochester，Rochester 14624，USA）

ObjectiveTo investigate the possibility that neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-1（NEDD4-1）regulates ubiquitination of the tyrosine kinase A（TrkA）in prostate cancer cells and discuss the possiblemechanism thatNEDD4-1promotes invasion andmigration of prostate cancer cells.MethodsAfter transient over-expression NEDD4-1 in PC3 cells using liposome transfection method，the interaction between exogenous NEDD4-1 and TrkA was tested by using immunoprecipitation（Co-IP）combined with immunoblotting（IB）.After co-overexpression of NEDD4-1 and ubiquitin，the ubiquitination effectof TrkA was examined using Co-IP combined with IBmethod.After co-overexpression of NEDD4-1 and ubiquitin，the ubiquitinated TrkA levelwas analyzed with or without the proteasome inhibitor MG132 treatment.ResultsAfter overexpression of NEDD4-1 in PC3 cells，the exogenous NEDD4-1 was co-precipitated with TrkA.After co-overexpression of NEDD4-1 and ubiquitin，the TrkA was ubiquitinated by exogenous NEDD4-1.The ubiquitinated TrkA level was increased after proteasome inhibitor MG132 treatment，indicating that the TrkA degradation was blocked.Conclusion TrkA protein was one of the substrate of NEDD4-1 in prostate cancer cells；NEDD4-1 regulates ubiquitination of TrkA and promots its degradation in proteasome.

prostate cancer；NEDD4-1；TrkA；ubiquitination

R285.5

A

1005－1678（2014）08－0001－04

国家自然科学基金（81202037）

汪治宇，男，博士，副教授，研究方向：肿瘤免疫学，E-mail：wzyu79＠163.com；单保恩，通信作者，男，博士，教授，研究方向：免疫学，E-mail：danbaoen＠163.com。