三乙酰更昔洛韦的HPLC定量分析方法

郝六平，魏转，薛娜，黄文杰，马丽锋

（河北化工医药职业技术学院制药工程系，河北石家庄050026）

三乙酰更昔洛韦的HPLC定量分析方法

郝六平，魏转，薛娜，黄文杰，马丽锋

（河北化工医药职业技术学院制药工程系，河北石家庄050026）

目的建立三乙酰更昔洛韦的高效液相色谱定量分析方法，为企业决定是否回收三乙酰更昔洛韦提供依据。方法三乙酰更昔洛韦稀释后进高效液相色谱。色谱柱为COSMOSIL 5C18-PAQ Packed Column（4.6mm×250mm）；流动相为甲醇-水（10∶90）；检测波长：255 nm；柱温：25℃。结果该方法测得回归方程为ΔA＝1156C（μg／mL）-262，相关系数r为0.9999。线性范围为1～40μg／mL，定量限为1μg／mL，精密度RSD为0.6%，重复性RSD为0.2%。母液中浓度为23.2μg／mL。结论所建立的HPLC法，简单、准确、灵敏、重复性好。

三乙酰更昔洛韦；定量分析；高效液相色谱

更昔洛韦是一种2-脱氧鸟嘌呤核苷酸的类似物，可抑制疱疹病毒的复制，能够预防及治疗免疫功能缺陷患者的巨细胞病毒感染，如接受化疗的肿瘤患者及使用免疫抑制剂的器官移植患者、巨细胞病毒性视网膜炎和巨细胞病毒性肺炎［1-3］。报道了多种更昔洛韦的合成方法［4-11］，其中三乙酰更昔洛韦（triacetylganciclovir）是生产更昔洛韦的中间体［11］。在更昔洛韦化学合成过程中，母液中存在一定量的三乙酰更昔洛韦。定量分析母液中三乙酰更昔洛韦的含量是药品生产企业决定是否回收母液中三乙酰更昔洛韦的重要依据。生产更昔洛韦的企业目前还没有建立合适的三乙酰更昔洛韦的定量分析方法，本方法以更昔洛韦含量测定方法为基础［12］，对测定条件进行了摸索，方法操作简便，结果准确，可用于三乙酰更昔洛韦的含量测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪（北京诚创康韵医药科技有限公司）。色谱柱：COSMOSIL 5C18-PAQ Packed Column（4.6mm×250mm）。

三乙酰更昔洛韦对照品（99.3%）和三乙酰更昔洛韦母液（河北柏奇药业提供）；甲醇为色谱纯（江苏汉邦科技有限公司）；水为纯净水（自制），其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件：色谱柱：COSMOSIL 5C18-PAQ Packed Column（4.6mm×250mm），理论板数按三乙酰更昔洛韦峰计算应不低于3000；流动相：甲醇-水（10∶90）；检测波长：255 nm；柱温：25℃；进样量：20μL。

1.2.2 标准品溶液的制备：精密称取三乙酰更昔洛韦对照品约25mg，置25mL容量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液1mL使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，加流动相定量稀释制成每1mL中含三乙酰更昔洛韦40μg的溶液，即为标准品溶液。将此标准品溶液分别稀释成1、2、4、20μg／mL的系列标准溶液［12］。

1.2.3 供试品溶液的制备：三乙酰更昔洛韦母液中主要成分为溶剂乙酸乙酯，并含有微量的三乙酰甲氧甘油和双乙酰鸟嘌呤。三乙酰更昔洛韦母液用0.45μm滤膜过滤，精密量取滤液1mL，置100mL容量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液1mL使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀制成稀释100倍的供试品溶液，精密量取已稀释100倍的供试品溶液10 m L置100 m L容量瓶中，加流动相稀释至刻度摇匀制成稀释1000倍的供试品溶液。

2 结果

2.1 吸收光谱及测定波长的选择 标准品溶液进高效液相色谱仪，在190～300 nm进行扫描，以紫外吸收峰高为纵坐标，以吸收波长为横坐标绘制吸收图谱，确定最大吸收波长。图1中209 nm峰为溶剂甲醇吸收峰［13］，此外可知三乙酰更昔洛韦在255 nm处有最大吸收，故选择255 nm为测定波长。

图1 三乙酰更昔洛韦吸收曲线Fig.1 The absorption curve of triacetyl-ganciclovir

2.2 三乙酰更昔洛韦色谱峰 取浓度为4μg／m L的三乙酰更昔洛韦标准溶液20μL进样，在255 nm测定其紫外吸收（见图2），其色谱峰结果见表1。保留时间在2.8 min处的峰为甲醇峰［13］。

图2 4μg／mL的三乙酰更昔洛韦色谱图Fig.2 The chromatogram of triacetyl-ganciclovir of4μg／mL

表1 三乙酰更昔洛韦色谱峰结果Tab.1 The results of chromatogram of triacetyl-ganciclovir

2.3 标准曲线的绘制 分别取浓度为1、2、4、20、40μg／mL的三乙酰更昔洛韦标准溶液20μL进样，在255 nm测定其紫外吸收面积，以紫外吸收面积为纵坐标，以三乙酰更昔洛韦溶液浓度为横坐标进行一元线性回归，得到回归方程：

ΔA＝1156C（μg／mL）－262，相关系数r为0.9999，定量限为1μg／m L（见图3）。在该实验条件下，三乙酰更昔洛韦溶液浓度在1～40μg／mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图3 标准曲线Fig.3 Standard curve

2.4 精密度实验 取浓度为4μg／mL的标准溶液，按照1.2.1项下的色谱条件进行测定，连续进样5次，以峰面积计算精密度，RSD为0.6%，结果表明仪器精密度良好。

2.5 重复性实验 精密称取对照品适量，按1.2.2项下的方法平行制备6份供试品溶液，按1.2.1项下的色谱条件进行测定，计算样品含量平均值为（99.6±0.2）%，结果表明该方法重复性良好。

2.6 母液样品的测定 取过滤稀释后的三乙酰更昔洛韦母液20μL进样5次，在255 nm测定其紫外吸收面积平均值为（26557.0±1.3）%mV·s，按照所得一元线性回归方程计算出母液中三乙酰更昔洛韦浓度为23.2μg／mL，换算后原母液中三乙酰更昔洛韦浓度为23.2 kg／m3。企业可依据此数据判断是否需要从母液中回收三乙酰更昔洛韦。

3 讨论

本研究建立的HPLC测定三乙酰更昔洛韦含量的方法简单、灵敏、准确。实验表明，三乙酰更昔洛韦在实验条件下，具有良好的紫外吸收特性，其浓度与紫外吸收面积线性范围良好，此方法能够满足企业对三乙酰更昔洛韦的定量测定。企业可以依据实验所得数据，综合考虑各种生产要素带来的成本和回收母液中三乙酰更昔洛韦的经济效益和社会效益，决定是否有必要对其进行回收利用。

由于母液样品中含有不溶性固体，为了避免将色谱柱堵塞，配置母液供试品时需要先过滤。滤渣需要用少量0.4%氢氧化钠溶液进行洗涤，将洗涤液和滤液合并后再进行供试品溶液的制备，以避免由于过滤可能带来的三乙酰更昔洛韦的损失。此外，由于生产过程的不稳定性，企业可以根据三乙酰更昔洛韦的投料量、更昔洛韦产量、母液体积等参数以及企业自身积累的工作经验预先考虑母液中三乙酰更昔洛韦的浓度大小，以免稀释1000倍后的浓度超出本方法确定的线性范围。

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（编校：王俨俨）

Quantitative analysis of triacetyl-ganciclovir by HPLC

HAO Liu-ping，WEIZhuan，XUE Na，HUANGWen-jie，MA Li-feng

（Department of Pharmaceutical Engineering，Hebei Chemical and Pharmaceutical College，Shijiazhuang 050026，China）

ObjectiveTo establish a HPLCmethod for determination of triacetyl-ganciclovir and provide the basis for enterprises to decidewehther the triacetyl-ganciclovir should be recycled or not.MethodsTriacetyl-ganciclovir was diluted with mobile phase for high performance liquid chromatography（HPLC）analysis.The chromatography was performed on a COSMOSIL 5C18-PAQ Packed Column（4.6 mm×250 mm，5μm）with methanol-water（10∶90）as themobile phase.The eluentwas detected at255 nm with 25℃of column temperature.ResultsThe regression equation wasΔA＝1156C（μg／mL）-262（r＝0.9999），linear range was 1-40μg／mL，and the LOQ was 1μg／mL with good precision（RSD＝0.6%）and repeatability（RSD＝0.2%）.The concentration of triacetyl-ganciclovir was 23.2μg／mL in mother liquor.Conclusion The HPLC method for determination of triacetyl-ganciclovir is simple and accurate with high sensitivity and repeatability.

triacetyl-ganciclovir；quantitative analysis；high performance liquid chromatography

R917

A

1005－1678（2014）08－0183－03

河北化工医药职业技术学院院级课题（YZ201214）

郝六平，硕士，讲师，工程师，研究方向：发酵技术与药物分离纯化，E-mail：haoliuping＠126.com。